miércoles, 10 de agosto de 2016

MICROBIOLOGÍA EN CARDIOLOGÍA




MODULO: APARATO CARDIOVASCULAR
CICLO ll DE LA CARRERA DE MEDICINA


M.C. MARIO MARTINEZ ROBLES
Q.F.B CLAUDIA MARTINEZ CARRERA















“El conocimiento científico es patrimonio Universal “



Un agradecimiento especial para Fernando Gabriel Ranea  por su autorización  desde Buenos Aires, Argentina, para el uso de las imágenes de sus páginas de internet  fgranea@microbiología.com.ar  y http://www.microbiologia.org.ar de manera gratuita para la elaboración de este material de apoyo didáctico para los estudiantes Universitarios.



M.C. Mario Martínez Robles.
Profesor de Asignatura A definitivo.
Microbiología  y  Clínicas médicas.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza UNAM.



MéxIco D.F., a  20 de julio 2016.








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ÍNDICE
Pags.
Reacciones febriles (Práctica No. 10)
128
Objetivos
128
Género Salmonella  clasificación.
129
Morfología y medios de cultivo para Salmonellas.
130
Género Brucella.
131
Características morfológicas del género Brucella .
132
Género Proteus, morfología y clasificación .
132
Género Ricketsiae morfología.
133
Ricketsias, antígenos y enfermedades.
133
Técnica para la recolección de la muestra de sangre.
134
Método de aglutinación rápida en placa.
135
Títulación del suero e interpretación de resultados.
135
Método de aglutinación en tubo títulación  y resultados.
137
Reacciones positivas, títulos para Salmonellas, Brucellas y Rickettsias
137
Cuestionario.
138
Paludismo (Práctica No. 11).
139
Objetivos.
139
Clasificación del género Plasmodium.
140
Ciclo vital de las especies del género Plasmodium.
141
Plasmodium falciparum, Paludismo terciano maligno.
143
Plasmodium falciparum, esquizontes eritrocitarios  y trofozoítos.
144
Plasmodium vivax  paludismo terciano benigno.
145
 Plasmodium vivax  esquizontes maduros y trozoítos.
145
Plasmodium ovale esquizontes maduros, merozoítos y trozoítos.
146
Plasmodium malarie Paludismo cuartano.
146
Plasmodium malarie esquizontes y merozopitos.
146
Coloración de Giemsa.
150
Extendidos delgados y gruesos.
152
Cuestionario.
152
Tripanosomiasis (Práctica No, 12).
153
Objetivos.
153
Clasificación del género Tripanosoma
154
Ciclo biológico.
157
Morfología e identificación.
158
Métodos de diagnóstico.
160
Cuestionario.
160
Hemocultivo (Práctica No. 13).
161
Objetivos.
161





ll



INDICE
Pags.
Septicemia y  shock séptico, agentes etiológicos
162
Toma de la muestra de sangre  para el hemocultivo
163
Método de siembra  en el medio Ruiz Castañeda..
167
Interpretación de resultados en medios sólidos y líquidos
167
Cuestionario.
168
Resiembra en medios selectivos (Práctica No. 14).
169
Objetivos.
169
Agar S-110, Agar Sal manitol para Staphylococcus aureus
170
Agar sangre de carnero para Streptococcus y Diplococcus.
171
Agar  chocolate para el aislamiento de Haemophylus influenzae
171
Agar Sabouraud glucosado para el aislamiento de hongos
171
EMB, Agar Mac Conkey, SS, aislamiento de Enterobacteriaceae.
172
Método de siembra en medios selectivos.
172
Cuestionario.
175
Identificación por pruebas bioquímicas (práctica No. 15)
175
Objetivos.
175
Tinción de Gram y morfología colonial para la elección de los medios.
176
Pruebas para la identificación del género Streptococcus.
176
Pruebas  para la  identificación de Staphylococcus aureus.
177
Pruebas para la identificación de Streptococcus pneumoniae.
177
Pruebas para la identificación de Haemophylus influenzae.
178
Identificación de Géneros y especies de Enterobacteriaceae.
178
Fundamento del uso de Azúcares como pruebas bioquímicas en TSI.
180
Fundamento de la producción de ácido sulfhídrico (H2S) SIM.
181
Fundamento de la producción de Indol en SIM.
182
LIA .- Técnica de siembra y descarboxilación de la lisina.
183
LIA.- Producción de sulfuro ferroso
184
Técnica de siembra y fundamentos bioquímicos en MIO
184
Técnica de siembra y fundamentos bioquímicos en Citrato de Simmons
186
Técnica de siembra y fundamentos bioquímicos en urea de Christian.
187
Material para el desarrollo de la práctica
188
Cuadro de pruebas bioquímicas de la familia  Enterobacteriaceae.
190
Resultado de pruebas con el Género Salmonella,  en Imágenes.
191
Resultado de pruebas con el Género Escherichoa coli,  en Imágenes.
191
Resultado de pruebas con el Género Proteus,  en Imágenes.
192
Cuestionario.
192
Bibliolgrafía.




128


Práctica No. 10

REACCIONES FEBRILES

OBJETIVOS

1.- El alumno conocerá las características morfológicas de las especies patógenas de los géneros Salmonella, Brucella, Proteus y Rickettsia.

2.- El alumno conocerá los antígenos específicos identificables por pruebas serológicas, de los géneros Salmonella, Brucella, Proteus y Rickettsia.

3.- El alumno conocerá la importancia de las pruebas serológicas para el diagnóstico de las enfermedades producidas por los géneros Salmonella, Brucella, Proteus y Rickettsia.

4.- El alumno conocerá la importancia del uso de antígenos del Génerp Proteus para el diagnóstico de las enfermedades producidas por el género Rickettsia.

5.- El alumno conocerá los métodos para la aglutinación en placa y en tubos.

6.- El alumno conocerá la técnica para la toma de la muestra del suero.

7.- El alumno aplicará la técnica para la prueba de aglutinación en placa.

8.- El alumno el alumno aplicará la técnica para la interpretación de resultados en placas.

9.- El alumno  aplicara la técnica para la prueba de aglutinación en tubos.

10.- El alumno el alumno aplicará la técnica para la interpretación de resultados.



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REACCIONES  FEBRILES

                                                                                                                                                       

SALMONELLAS

Las Salmonellas son bacterias, móviles, anaerobias facultativas,  en forma de bacilos Gram negativos clasificadas dentro de la familia Enterobacteriaceae, frecuentemente son patógenas para el hombre y animales produciendo enteritis, infección generalizada y fiebres intestinales.

La clasificación del género Salmonella hasta 1983, hacía referencia  a un solo género con 3 especies:

Salmonella typhi (1 serotipo)
Salmonella cholerae suis (1 serotipo)
Salmonella enteritidis (más de 1500 serotipos.

Posteriormente se ha designado a este género, el nombre de Salmonella que incluye a una sola especie, Arizona (Salmonella  = género,  Arizona = especie) con seis subespecies, clasificadas en el estudio de ADN. Sin embargo, los reportes de laboratorio, designan a las Salmonellas con el nombre del género utilizando el nombre de la especie con la nonmeclatura anterior, adicionando o no el serogrupo, por lo que la aceptación del serogrupo no ha sido aceptada del todo.

Existe una clasificación ecológica de acuerdo a la adaptación y preferencia de las Salmonellas  por las especies  animales que le sirven de huésped o reservorio:

GRUPO A: Serotipos adaptados al hombre.
Salmonella typhi,  S. parathyphi B,  S. hirschfeldi  y  S. sendai. No tienen reservorio zoonótico, la infección de los animales es rara y accidental, el hombre es el único reservorio. La fuente de infección son las heces de personas infectadas.

A causa de su importancia clínica, deben identificarse  tres especies:
S. Typhi, S. choleraesius y S. Paratyphi A.

GRUPO B: Serotipos muy adaptados a huéspedes no humanos.
Salmonella pollorum, S. dublin, S. abortus, S. ovis, S. typhisis, S. gallinarum, S. abortusequi, y S. cholerae suis, iinfectan a pollos, gallinas, reses, caballos, carneros y cerdos. S. dublin y S. cholerae suis esporádicamente causan infección en el hombre.



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GRUPO C.- Serotipos no adaptados a huéspedes específicos. Más de 1,700 serotipos, producen en el humano gastroenteritis de corta duración, con un periodo de incubación corto, raramente invaden la sangre, la fuente de infección al hombre son las heces de animales, del hombre y  productos alimenticios (huevos, carne, leche y otros productos lácteos infectados).

Morfología

Las Salmonellas  son bacilos rectos Gram negativos, de 0.7 a 1.5 micras de diámetro por 2 a 5 de largo, móviles por tener flagelos perítricos, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas, no fermentan lactosa, la producción de Indol es variable (Positivo o negativo según especie), producen sulfuro de hidrógeno, descarboxilan la lisina y ornitina, reducen nitratos a nitritos, el citrato comúnmente es utilizado como única fuente de carbono y son ureasa negativas.

Medios de cultivo

El Agar con Eosina y Azul de metileno es útil para el aislamiento de los bacilos entéricos Gram negativos. El colorante  Azul de metileno inhibe el crecimiento de Gram positivos. El Agar de Mac Conkey también se puede usar para el aislamiento de organismos coniformes Gram negativos. El colorante violeta cristal y las sales biliares que contiene el medio inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas,

Estructuras antigénicas

Aunque las especies del género Salmonellas se identifican,  inicialmente por sus características bioquímicas, también es posible su identifican  mediante análisis  antigénico (pruebas serológicas) o reacciones febriles.

Las Salmonellas poseen  diversos antígenos  O   y   diferentes  antígenos  H en una o ambas fases.  Algunas Salmonellas  cuentan con antígenos capsulares  (K),  conocidos como de virulencia (Vi), que pueden producir una reacción de aglutinación  por antisueros  O  y que se relacionan  con la infección activa o anterior por alguna especie de Salmonella.

Antígenos  O.- Constituyen la parte más externa  de los lipopolisacáridos de la pared celular,  consisten en unidades repetidas  de polisacáridos. Algunos polisacáridos  O específicos contienen azúcares  únicos. Los anticuerpos contra los antígenos  O  son, de manera predominante  Ig M. Antígenos  K.-  Son externos en relación  con los antígenos  O  algunos son polisacáridos, otros son proteínas.  Los antígenos  K  pueden relacionarse con la virulencia.





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Antígenos H.- Están localizados sobre los flagelos, el calor  y el alcohol los desnaturaliza o eliminan. Estos antígenos H se aglutinan con anticuerpos anti H, principalmente del tipo Ig G. Los aspectos determinantes de los antígenos H son una función de la secuencia de los aminoácidos  de la proteína flagelar (flagelina).

Identificación de Salmonellas por métodos serológicos

Prueba de aglutinación en placa.- Para esta prueba se utiliza el suero del paciente y antígenos conocidos de Salmonellas. La aglutinación se produce en unos cuantos minutos, es una  prueba para la  Identificación preliminar rápida de especies.

Prueba de aglutinación por dilución en tubo (prueba de Widal).- Las aglutininas séricas aumenten durante la segunda  y tercera semana de infección. Son necesarias dos muestras de suero en intervalo de siete a diez días para comprobar aumento de anticuerpos. Se utilizan el suero del paciente y antígenos conocidos de Salmonellas.



BRUCELLAS         

El género Brucella, descrito en 1920 por Meyer y Shaw, está formado por bacterias parásitas intracelulares facultativas, que producen el aborto en muchas especies domésticas de animales y enfermedades febriles, septicémica o infecciones focalizadas en el hombre. El descubrimiento del agente etiológico de la enfermedad, conocida como fiebre de Malta, se realizó a finales del siglo XIX, por un grupo de investigadores encabezados por D. Bruce. Con base en las características coloniales y microscópicas, la bacteria se denominó Micrococcus mellitensis.

Las Brucellas tienen preferencia marcada por el huésped animal, así se tiene que B. abortus infecta normalmente al ganado bovino, B. mellitensis se relaciona mas con cabras y borregos, B. suis con cerdos, B. canis infecta perros, B. ovis causa infección específicamente a borregos y B. neotomae a roedores. El hombre es susceptible a cualquiera de las cuatro primeras especies.

La brucelosis es una enfermedad que se adquiere al ingerir leche o queso no pasteurizados o a través de la piel que se pone en contacto con secreciones de animales contaminados. Las Brucellas se diseminan por vía hemática y linfática.

En los ganglios linfáticos, hígado, bazo, médula ósea y otros tejidos desarrollan nódulos granulomatosos en forma de abscesos. 



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La enfermedad aguda o crónica se manifiesta principalmente por escalofríos, mialgias, artralgias, debilidad ocasionando postración. Los episodios febriles en pico de predominio vespertino culminan con diaforesis profusa lo que ha dado lugar al nombre de fiebre ondulante. El deterioro meníngeo, encefálico, renal  y  hepático peden terminar con la vida del enfermo.

Morfología microscópica


Las Brucellas son bacilos cortos pequeños Gram negativos de 0.5 X 0.5 hasta 1.5 micras de longitud, al emplear la tinción de Zielh-Neelsen modificada, las Brucellas se tiñen de color rojo. Otras bacterias se verán verdes.




PROTEUS

Bacterias Gram negativas de la familia Enterobactereaceae, son bacilos de 0.4 a 0.8 micras de diámetro por 3 micras de longitud, móviles por flagelos perítricos, hidrolizan la  urea, producen  ácido sulfhídrico H2S y otros ácidos a partir de mono y disacáridos. Las especies del género Proteus forman parte de la flora normal del intestino del hombre, sin embargo, son oportunistas capaces de producir enfermedades diarreicas, infecciones urinarias, neumonía, septicemia y muerte en pacientes debilitados. El género Proteus   comprende cuatro especies:

 Proteus vulgarisProteus mirabilis,  Proteus myxofaciens, Proteus pennen



133



Estructuras antigénicas

El género Proteus a semejanza del resto de los miembros de la familia Eneterobactreaceae,  presenta antígenos somáticos de los cuales se reconocen 17 para P. Vulgaris, 27 para P mirabilis y otros 5 compartidos por ambas especies, en tanto que los antígenos flagelares (H) son 19.

La reacción cruzada que presentan estas bacterias son frecuentes por lo que la prueba de antígenos flagelares ocupados en la diferenciación es limitado. El antígeno capsular (k) designado como antígeno C ha sido demostrado en las especies de P. vulgaris y P. mirabiilis. En las otras dos especies no ha sido examinado.



 RICKETSIAS

Las Ricketsias son bacterias pleomórficas que pueden tener forma de coco o de bacilos, son azules a la tinción de Giemsa, miden 400 milésimas de micra aproximadamente, se localizan intracelularmente y solo pueden ser cultivadas en células vivas, hecho que dificulta su identificación, sin embargo las Rcketsias que causan enfermedades febriles en el hombre, tienen componentes antigénicos  idénticos a los del género Proteus (antígenos OX-19, OX-2, OX-K), esta relación se utiliza para el diagnóstico del tifo, enfermedad causada por Rcketsias, en la prueba de Weil-Félix. 

            Las infecciones por Ricketsias se caracterizan por producir signos y síntomas como malestar general, cefalea, fiebre de hasta dos semanas o crónica, postración, exantemas, úlceras, escaras,  hepatomegalia y esplenomegalia.  El tifo endémico es grave y con frecuencia mortal. La fiebre manchada como la  fiebre de las montañas Rocallosas, la fiebre del Mediterráneo y la fiebre Brasileña varían en su severidad, en ancianos pueden ser mortales.

La inmunidad por lo general es de larga duración, con algunas excepciones: (1) el tifus endémico puede causar recaídas 10-20 años después de la aparente recuperación (enfermedad de Brill Zinsuer), (2) la fiebre de las trincheras se caracteriza por las recaídas.





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REACCIONES FEBRILES

Son reacciones de aglutinación entre los antígenos (Salmonella, Brucella y Proteus OX-19) y los anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero del paciente.

Contenido del equipo

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno “O” (Somático 9, 12) de Salmonella typhi.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno “H” (Flagelar s) de Salmonella typhi.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno flagelar “ Paratyphi A”.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno (flagelar b, 1,2) “ Paratyphi B”.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno “BrucellaBrucella abortus.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 5 ml de antígeno “Proteus  OX-19”.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 2 ml o 5 ml de control positivo.

1.- Frasco gotero con tapón de rosca conteniendo 2 ml o 5 ml de control negativo.


Material y equipo necesario adicional:
Agitador de placas
Placas de vidrio con divisiones
Aplicadores


 Recolección y manejo de las muestras

La sangre se colecta por punción venosa con los cuidados pertinentes de antisepsia, 3 ml de sangre son suficientes, se deja coagular y se separa el suero por centrifugación a 2,500 r.p.m. durante 5 minutos. Cuidar el balance del peso de los tubos de ensaye para mantener el equilibrio en la centrífuga.





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MÉTODO DE AGLUTINACIÓN RÁPIDA EN PLACA

1.- Utilizar de preferencia una placa de vidrio marcada con 5 hileras de 6 cuadros.
2.- Anotar el antígeno que le corresponde a cada serie.
3.- Depositar en los cuadros de cada serie 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml de suero del paciente de izquierda a derecha.
4.- Agregar una gota de antígeno en cada una de las cantidades de suero.
5.- Mezclar con  un aplicador limpio, comenzando con la última dilución de la derecha y siguiendo con las restantes de la izquierda (utilizar un aplicador por cada serie).
6.- Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m.) durante 2 a 3 minutos
7.- Leer con luz indirecta.

Controles.- Para el método de aglutinación rápida en placa el control positivo tiene un título mínimo de 1:80 con cualquiera de los antígenos.

Control negativo.- No debe mostrar aglutinación con ninguno de los antígenos.


Interpretación  de los  resultados

Método de aglutinación rápida en placa. Se observa la aglutinación macroscópica y se valoran los resultados en la siguiente forma.

Grado de aglutinación
100%                     4 +
  75%                     3+
  50%                     2+
  25%                       +
     0                         --
El punto final de la aglutinación será la máxima dilución del suero que muestra una aglutinación de 2+

Ejemplo:
Suero (ml)                             0.08      0.04      0.02       0.01       0.005
Aglutinación                           4+          4+        3+          2+
Titulo correspondiente          1/20      1/40     1/80       1/160      1/320

Resultado: Una titulación positiva de 1/160 indica una gran probabilidad de enfermedad activa, la  titulación deberá repetirse a la semana, mientras tanto, los estudios complementarios como hemocultivo, tinción de Giemsa, etc. Confirmarán el diagnóstico y reorientarán el tratamiento.



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MÉTODO DE AGLUTINACIÓN EN TUBO

1.- Numerar 7 tubos (12 x 75 mm) del 1 al 6 y un testigo (T) para cada antígeno.
2.- Adicionar 0.9 ml de solución salina al primero y 0.5 ml a los restantes.
3.- Agregar 0.1ml del suero problema al tubo 1 que ahora tendrá 1 ml., mezclar la suspensión y extraer 0.5 ml., para  pasarlos al tubo 2, quedando solo  0.5 ml., en el tubo número 1.
4.- El tubo número 2, ahora con 1 ml., de la suspensión deberá mezclarse para después extraerle 0.5 ml., que serán adicionados al tubo número 3.
5.- Así sucesivamente hasta el tubo 6, eliminando los 0.5 ml restantes de esta última dilución.
6.- De esta forma se obtienen  diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320, del suero problema en solución salina.
7.- Adicionar 0.5 ml de antígeno diluido previamente 1.20 con solución salina en cada uno de los tubos.
5.- Agitar enérgicamente e incubar en baño maría en las siguientes condiciones:

Antígeno                             Temperatura                        Tiempo
Salmonella “O”                     48-50”C                                18 a 24 horas
Salmonella “H”                     37°C                                     2 horas
Paratíficos “A” y “B”             48-50°C                                 2 horas
Brucella                               37°C                                      48 horas
Proteus OX-19                     37°C                                      18 horas


Resultados del método de aglutinación en tubo

Observar los tubos testigos que no deben mostrar aglutinación, tomar 2 o 3 tubos a la vez, agitarlos ligeramente frente a una fuente de luz que ilumine las partículas claramente.

Reportar al título del suero, empleando la reciproca de la dilución más alta, que da una aglutinación de 2 +.

Hacer las lecturas en la siguiente forma:
Grado de aglutinación
100% ++++ Sedimentación de los grumos y el sobrenadante claro.
75% +++ Grumos sedimentados casi totalmente y sobrenadante claro.
50% ++ Sedimentación marcada y sobrenadante ligeramente claro.
Negativo.  Ninguna evidencia de aglutinación, sobrenadante idéntico al control.




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Salmonella.- El método en placa es una prueba de escrutinio y debe considerarse como tal, ya que la prueba de Widal está sujeta a gran número de variables, los resultados dependerán del estado de la enfermedad y del aumento en el título solo en la segunda semana de la enfermedad. 

El nivel “normal” de aglutininas variará en diferentes poblaciones y circunstancias; por ejemplo los adictos a los narcóticos tienen niveles más elevados de anticuerpos S. typhi O y H.  La terapia antimicrobiana retardará el aumento de titulo, y la inmunización previa incrementará los anticuerpos O y H, o también puede aumentar en cualquier periodo febril.  El concepto de titulo “normal” en aglutininas febriles ha llegado a ser algo irrelevante, siendo mejor examinar un incremento en el titulo después de un estudio inicial.

Un titulo O (somático) significante y sospechoso para S. typhi es 1:160 pero un aumento del titulo en una repetición se considera más importante.

La presencia de antígenos comunes entre Brucella suis, Proteus, Salmonella y Vibrio cholerae, darán reacciones cruzadas.



Brucella.- Casi todos los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas de 1:160 o mayor en el transcurso de 3 semanas después de la infección; los títulos pueden persistir en cifras bajas durante meses o años, especialmente en los enfermos con infección crónica, hay un problema de reacción cruzada serológica, con Francisella tularensis, vibrio cholerae y ciertas cepas de Yersinia enterocolitica.



Proteus OX-19.- El menor titulo que puede considerarse significativo es 1:160 (dilución final), un aumento del titulo debe ser por lo menos cuádruple para considerarse importante. Los títulos máximos se encuentran generalmente durante la tercera semana después de la iniciación de la enfermedad.



La fiebre Q y la Rickettsiasis pustulosa no dan una prueba positiva del Weil-Félix.

Las infecciones por Proteus y la fiebre recurrente causada por espiroquetas del genero Borrellia también causan aumento de las aglutininas de Weil Félix.




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RECOMENDACIONES

1.- No congelar ninguno de los reactivos.
2.- Evitar utilizar los reactivos fríos.
3.- La mayoría de los sueros considerados como normales pueden mostrar títulos de 1:20, 1:40 y ocasionalmente 1:80.
4.- La presencia de títulos bajos puede ser debida a vacunaciones, a infecciones pasadas o subclínicas.
5.- La mejor indicación de un proceso activo lo marcan dos titulaciones sucesivas con una diferencia importante entre el primero y segundo titulo, lo que nos indicaría infección activa, aunque también se observa esto en los convalecientes.
6. Es conveniente estudiar varias muestras de sangre del enfermo con diferencia de 5-7 días en los casos dudosos.

Caducidad y conservación.- Equipo completo.
La fecha de caducidad para cada equipo se encuentra impresa en la etiqueta exterior, la temperatura recomendada para conservarse es entre + 2° a + 8°C.
Frascos individuales, la fecha de caducidad se encuentra impresa en la etiqueta y pueden conservarse entre +2 y 8°C.

Control de calidad.- Es recomendable el uso de los controles, tanto positivo como negativo para asegurar la validez de los resultados  dados.




CUESTIONARIO

1.- ¿Cuales son los antígenos identificables del género Salmonella ?
2.- ¿Cuales son los antígenos identificables del género Brucella ?
3.- ¿Cuales son los antígenos identificables del género Proteus ?
4.- Explique el fundamento para utilizar antígenos del género Proteus, para el
    diagnóstico de las enfermedades producidas por el género Rickettsia ?
5.- Describa la técnica para la toma de la muestra de sangre.
6.- Describa la técnica para obtener el suero.
7.- Describa la técnica de aglutinación en placas.
8.- Describa la técnica de aglutinación en tubos.
9.- Describa la técnica para la interpretación de resultados.
10.- Explique el fundamento de la aglutinación.



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Práctica No. 11

PALUDISMO


Objetivos

1.- El alumno conocerá la morfología de las especies del género Plasmodium.

2.- El alumno conocerá el ciclo vital de las especies del género Plasmodium.

3.- El alumno conocerá la técnica de frotis para extendidos gruesos.

4.- El alumno conocerá la técnica de frotis para extendidos delgados.

5.- El alumno conocerá la técnica de tinción con coloración de Giemsa.










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Introducción

Existen algunos parásitos eucarióticos que afectan ya sea de manera transitoria o permanente la sangre y los tejidos del cuerpo humano, provocando en los individuos portadores, diferentes cuadros que pueden ser desde un estado asintomático el cual  no puede considerarse como un estado de completo bienestar físico, hasta un cuadro clínico tan severo que ponga en riesgo la vida.

Los microorganismos de importancia médica que pertenecen al reino protista, se encuentran clasificados en siete Phylos: Sarcomastigophora, Apicomplexa, Microsporida, Ciliosphora,  Mixospora, Labyrinthomorpha y Ascetospora.

El phylum Apicomplexa agrupa a dos subclases: Gregarinia y Coccidia. La subclase Coccidia incluye a un solo Orden, Eucocidia que a su vez agrupa a tres subórdenes de los cuales forma parte el Suborden Haemosporina.  Los microorganismos de la clase Sporozoea  de este suborden llevan a cabo un complejo ciclo de vida con fases reproductivas sexuales y asexuales alternadas, que suelen afectar a dos diferentes huéspedes; artrópodos y vertebrados, incluyendo al hombre.

  En la clase Sporozoea se encuentran agrupados esporozoarios sanguíneos que incluyen al género Plasmodium

El paludismo es una enfermedad causada por parásitos de la sangre, del género Plasmodium de gran  prevalencia en  los países en desarrollo, con 150  a 200 millones de casos que causan más de un millón de muertes al año.  Cada año se diagnostican de 300  a 400 casos en Norteamérica que son informados a los Centers for Disease Control (CDC) siendo menos común en países industrializados,

            El paludismo se transmite al ser humano por inoculación de los esporozoítos infecciosos a través de una gama de mosquitos, se conocen unas 60 especies de mosquito anópheles capaces de transmitir el paludismo. Esta enfermedad también puede ser transmitida por transfusión de sangre o productos sanguíneos infectados, incluyendo material no esterilizado así como el uso de las mismas jeringas entre drogadictos. Otro mecanismo de transmisión es el congénito.

El paludismo es causado por cuatro especies de protozoarios del género Plasmodium: Plasmodium falciparum, Plasmodium  vivax, Plasmodium malarie y Plasmodium ovale.






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Las infecciones causadas por Plasmodium falciparum son mas fulminantes que las producidas por otros Plasmodios y pueden provocar estado de coma e insuficiencia renal en dos a tres días. Además las infecciones por Plasmodium falciparum son a menudo resistentes a la cloroquina. Por lo que el laboratorio debe proveer un diagnóstico rápido de las especies para elegir agentes antipalúdicos adecuados y anticipar a las probables complicaciones.

Existen diferencias entre las especies de Plasmodios en cuanto a la morfología de las diferentes fases de su desarrollo y los tiempos de cada una de las secuencias o estadios, algunas de estas diferencias son de gran importancia para la identificación de las especies.


Ciclo vital

El vector y huésped definitivo para los Plasmodios es la hembra del mosquito anópheles, solo la hembra se alimenta de sangre. Existen dos fases en el ciclo vital de los Plasmodios, la fase sexual y la fase asexual.

El ciclo sexual ocurre en los mosquitos y recibe el nombre de “esporogonia”, debido a que da origen a esporozoitos. El ciclo asexual se lleva a cabo en el hombre (huésped intermediario) y recibe el nombre de “esquizogonia” debido a que origina esquizontes.

El ciclo vital en el hombre comienza con la introducción de los esporozoitos a la sangre desde la saliva del mosquito al picar. En el transcurso de 30 minutos, los esporozoitos viajan desde la lesión inicial por el torrente sanguíneo  hasta el hígado, donde infectan a los hepatocitos. En esta fase "exoeritrocitaria" el esporozoito multiplica su material citoplasmático, adoptando una nueva morfología llamada esquizogonia primaria exoeritrocítica, después de una demora de 8  a 25 días, según la especie del Plasmodium, el parásito madura dando origen a un esquizonte hepático "esquizonte criptozoico" con un tamaño entre 45  a 60 micras el cual se multiplica dando origen aproximadamente entre 10,000  a  40,000 merozoitos (según la especie) con un tamaño aproximado de 1  a 2 milimicras que poseen una membrana trilaminar.  A la membrana externa del parásito, se encuentra adherida una especie de glicocálix o cubierta, que es responsable de la fijación a los eritrocitos.

Plasmodium vivax y Plasmodium ovale producen una forma de merozoito latente (hipnozoito) en el hígado estas formas parasitaria son la causa de  las recaídas.



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Los merozoitos abandonan las células hepáticas e infectan a los eritrocitos "fase eritrocitaria".  Penetran en los hematíes por endocitosis, se adhieren por su polo anterior (anillo polar) con intervención directa de la cubierta del parásito a la membrana de los eritrocitos.

Substancias secretadas por los micronemas  y  roptrias del Plasmodium, provocan una invaginación de la membrana del hematíe  y se forma inicialmente una cavidad en forma de receptáculo o copa, en la cual se moverá el merozoito y posteriormente formará una vacuola parasitófora en la que quedará englobado.

Durante este proceso, la cubierta del merozoito queda retenida en la superficie del hematíe y finalmente es desprendida y  dispersada en  el plasma sanguíneo. Ya en el interior del eritrocito, el merozoito se nutre de la hemoglobina y se transforma en un cuerpo pequeño y redondo de forma anular (trofozoito maduro).

Posteriormente el núcleo de parásito se divide en varios fragmentos, pero sin división del citoplasma (esquizogonia eritrocitaria), para luego diferenciarse a esquizonte maduro, dando origen de (6  a 32) merozoitos dependiendo de cada especie, que rompen la membrana del eritrocito.



Algunos de estos merozoitos, así como los restos citoplasmáticos del parásito, son fagocitados por los macrófagos y células endoteliales libres de los vasos sanguíneos. Los restantes infectan a otros eritrocitos. Los esquizontes eritrocitarios maduros reciben también el nombre de formaciones en "roseta", pues existe siempre una masa citoplasmática residual con gránulos de pigmento, alrededor de la cual se sitúan los merozoitos.


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Este ciclo en los glóbulos rojos se repite a intervalos regulares típicos para cada especie. La liberación periódica  de merozoitos causa los síntomas recurrentes característicos de escalofríos, fiebre y diaforesis que presentan los pacientes con paludismo.

Ciclo sexual

El ciclo sexual comienza en el eritrocito humano cuando algunos merozoitos pasan a la forma de gametocitos masculinos y otros a gametocitos femeninos. Los eritrocitos conteniendo a los gametocitos son ingeridos por el mosquito hembra Anópheles y dentro de su intestino se forma un macrogameto femenino y ocho microgametos masculinos parecidos a espermatozoides. 


Después de la fertilización, el cigoto diploide se diferencia a oocineto móvil, que horada la pared intestinal del insecto formando una madriguera en donde crece el oocineto a oocisto enquistado, dentro del cual se producen numerosos esporozoitos haploides. Los esporozoitos se liberan y emigran a las glándulas salivales del insecto, listos para completar su ciclo cuando el mosquito pica a un individuo para ingerir su sangre, introduciendo a los esporozoitos.


Plasmodium falciparum es la especie más importante, la cual causa paludismo terciano maligno o subterciario, caracterizado por la presencia de ciclos de fiebre que se presenta cada 36  a 48 horas. Plasmodium falciparum es la especie predominante en la mayoría de los lugares tropicales y es la causa de entre el 80 y el  90 % de las infecciones de paludismo en aquellas zonas.


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La fase hepática de esta especie en el hombre dura de 8  a 10 días y se cree que solo es una población de parásitos que se desarrollan sincrónicamente en cualquier momento. El esquizonte hepático totalmente desarrollado contiene unos 40,000 merozoitos, cantidad considerablemente mayor que en otras especies (10,000  a 20,000 en promedio).

Los esquizontes eritrocitarios maduros de Plasmodium falciparum  contienen entre 8  y  32 merozoitos, con un promedio de 20 merozoitos mas que otras especies.

Los trofozoitos adultos tienen forma de anillos pequeños  de 1.5 micras es común la frecuencia de varios trofozoitos  anillados en el interior de un eritrocito. El ciclo de infección en los eritrocitos es más rápido en el caso de Plasmodium falciparum (36  a 48 horas) en comparación con el resto de las especies.

El aumento en el número de parásitos en esta especie es por tanto mucho más rápido que en otras y esto, junto con la capacidad del parásito de atacar eritrocitos de todas las edades, provoca un rápido deterioro en la condición clínica del paciente no inmune, de aquí el término de "terciano maligno".



Para el paludismo por Plasmodium falciparum, con frecuencia la parasitemia es intensa, del 20 al 40 % de los eritrocitos pueden encontrarse infectados, en comparación con tal vez un 5 % en infecciones por otras especies y la repentina destrucción de este porcentaje de eritrocitos, tiene graves consecuencias para el paciente.



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Si bien se presentan esquizontes eritrocititos en la infección por Plasmodium falciparum, la gran mayoría de estas formas, en especial cuando la parasitemia es relativamente baja, los parásitos se encuentran en los vasos sanguíneos de los tejidos más profundos y no se ven en la sangre periférica. Los esquizontes se observan solo en frotis de sangre de pacientes moribundos.


Plasmodium vivax causa paludismo terciano benigno, en el cual el ciclo de fiebre se presenta cada 48 horas. Esta es la segunda especie más importante y se presenta en una área geográfica mucho mayor en comparación con P. falciparum, desde los  trópicos y subtrópicos hasta algunas zonas templadas del mundo. Ha producido infecciones endémicas en zonas del sur de Gran Bretaña en el pasado reciente y en la década de 1920, se transmitió hasta el mismo círculo Ártico.

Las fases eritrocitarias son morfológicamente distintas que las de Plasmodium falciparum, los esquizontes hepáticos de P. vivax, contienen menos merozoitos.


Los esquizontes maduros de Plasmodium vivax contienen de  14 a 24 merozoitos, los trofozoitos adultos tienen forma de anillos grandes y delgados  2 a 3 micras  de diámetro. Los eritrocitos viejos se infectan de manera preferencial y el porcentaje de células infectadas puede ser menor que en las infecciones por P. falciparum.


El paludismo vivax es por tanto menos grave en el paciente no inmune de aquí el término de "paludismo terciano benigno".



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Las recaídas de parasitemia y fiebre son frecuentes en la infección por Plasmodium vivax, pruebas recientes sugieren que estas recaídas son causadas por la presencia de dos o mas poblaciones de parásitos en las células hepáticas, una de las cuales se desarrolla como típicos esquizontes hepáticos y otra los llamados “hipnozoitos”, subsisten por algún tiempo como pequeños parásitos mononucleados que inician su ciclo de desarrollo después de semanas meses o años de la infección inicial, produciendo las llamadas recaídas.

El tratamiento de las fases eritrocíticas no es adecuado y se requieren tratamientos "eficaces" durante estos estadios. Es una diferencia con al paludismo falciparum, en el cual los medicamentos eficaces contra los estadios eritrocíticos por si solos permiten un tratamiento acertado.


Plasmodium ovale también produce ciclos de fiebre de 48 horas, por lo general es menos común que vivax en la mayoría de las zonas endémicas en las que ambos se presentan, con excepción en África occidental en donde ovale es más  común. Los esquizontes eritrocitarios maduros en roseta de Plasmodium ovale contienen de 6 a 12 merozoitos grandes. Los Trofozoitos maduros tienen forma de anillos grandes ocupan un tercio del eritrocito con  aproximadamente 2.5 micras de diámetro por lo general un granulo de cromatina, en forma de anillo grueso


Plasmodium malarie produce un ciclo febril de 72 horas (paludismo cuartano), normalmente se localiza en zonas tropicales, y subtropicales,  tiene mucha menor prevalencia que P. Falciparum y P. vivax. Los esquizontes hepáticos y eritrocíticos producen mucho menos merozoitos que las otras especies, por lo que la parasitemia suele ser baja, del orden de una célula infectada por cada 100  a 200 eritrocitos.


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Ciertas anormalidades genéticas que afectan a los eritrocitos, influyen en la susceptibilidad al paludismo. La deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de personas con genotipo "homocigotos" se relaciona con mayor resistencia de los eritrocitos a la invasión de los parásitos. También las personas con rasgos de células falciformes (heterocigotos) se protegen contra el paludismo debido a que sus eritrocitos tienen escasa actividad de ATPasa que no produce suficiente energía para respaldar la multiplicación del parásito, sin embargo estos pacientes rara vez viven lo suficiente para obtener algún beneficio de este hecho.

Manifestaciones clínicas

Periodo de incubación.- El tiempo que existe entre la infección y la aparición de los signos y síntomas clásicos, oscila entre los 9  a 40 días y varía en razón de la especie, siendo mas corto en infecciones por Plasmodium falciparum y más largo para P. malarie y determinadas cepas de P. vivax, aisladas en el norte de Europa y Rusia, para las que se ha propuesto el nombre de P. vivax ibernans.

Periodo Prepatente.- Tiempo transcurrido entre la infección (picadura del mosquito) y el primer hallazgo del parásito en la sangre, para P. malarie es de 3  a 4 días, para P. vivax y falciparum entre 11  a 15 días y para P. ovale 14  a 16 días.

Acceso o paroxismo palúdico.- Puede ir precedido de un periodo prodrómico con dolor torácico y abdominal, artralgias, náuseas, vómito e incluso fiebre, aunque sin carácter de perioricidad. El primer acceso palúdico señala el final del periodo de incubación y consta de tres etapas o fases bien diferenciadas:

1.- Fase fría o de escalofrío violento.

Los síntomas de esta fase reflejan la existencia de una descarga simpática con vaso  constricción periférica. Se caracteriza por escalofríos, cefalea frontal, mialgias, pulso rápido y débil, piel pálida, fría y seca con aspecto de "carne de gallina" (cutis anserina), cianosis labial y en dedos, náuseas, vómito y en menores pueden presentarse convulsiones, el tiempo de duración es de 1 a 2 horas.

2.- Fase de calor o periodo febril.

La temperatura corporal sube hasta 41° C. Se produce una intensa vasodilatación, la piel esta ardiente y seca y la cara congestionada. Hay cefalea intensa, taquicardia, taquipnea, dolor abdominal, náuseas, vómitos y en ocasiones tos y delirio. Es frecuente la presencia de hipotensión ortostática como consecuencia de la vasodilatación. La duración de esta etapa dura de 2 a 6 horas.



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3.- Fase de sudoración.

La temperatura corporal desciende hasta límites normales y el enfermo presenta una intensa diaforesis y poliuria. Este periodo tiene una duración de 2 a 4 horas.

A este primer acceso siguen otros durante un periodo de  tiempo no menor a 2 semanas. Entre un acceso y otro, el paciente esta asintomático, aunque en las infecciones por P. falciparum la fiebre puede persistir. Los accesos se presentan a intervalos regulares de tiempo; Cada 48 horas en los casos de P. vivax y P. ovale (terciano benigno); así como para P. Falciparum (terciano maligno). De 72 horas para P. malarie (cuartano).

No obstante, a veces no existe perioricidad, sobre todo al principio del cuadro clínico. Además, la mayor parte de las infecciones por P. falciparum no siguen el ritmo de terciana, los accesos febriles pueden aparecer diariamente e incluso es posible que exista fiebre continua. Sin tratamiento la enfermedad pasa a mostrar un curso clínico y suele curar al desarrollarse la inmunidad especifica varios años mas tarde, 5 años en casos de paludismo por P. vivax y P. ovale, de  20  a 30 años para casos de P. malarie.

El pronóstico del paludismo por P. falciparum es más sombrío, dado que, aunque la curación espontánea pueda presentarse al cabo de un año, lo normal es que el enfermo fallezca antes de ese tiempo.


Inmunidad

La respuesta inmunitaria se produce fundamentalmente frente a las formas asexuadas eritrocíticas. Los gametos y formas exoeritrocíticas no producen la  formación de anticuerpos, aunque estas últimas sean capaces de reaccionar con ellos. Los esporozoitos son inmunógenos experimentalmente, pero en infecciones humanas se desconoce este hecho. La mayor parte de las inmunoglobulinas sintetizadas (Ig M, Ig G e Ig A) en el curso de la infección palúdica, como consecuencia del estímulo de los parásitos intraeritrocitarios, carecen de actividad protectora.

El hecho principal en la patogenia del paludismo es la lisis de los hematíes parasitados y no parasitados, pues produce la  descarga en el torrente circulatorio de parásitos, pigmentos, restos celulares y material tóxico no identificado, que producen fiebre, anemia, hipoxia tisular, estímulo para la fagocitosis, pigmentación cutánea y de otros órganos, así como una serie de fenómenos inmunopatológicos.



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Examen físico

No existen adenopatías, pero si hepatomegalia. La palpación esplénica si se realiza de forma violenta es peligrosa y puede ser posible la ruptura visceral. La piel adquiere un tinte ocre y terroso y son frecuentes la urticaria "rash" petequial e incluso las hemorragias.


Datos de laboratorio

Hay anemia hemolítica normocrómica y normocítica, al menos al principio, leucopenia con granulocitopenia y linfopenia (relativa o absoluta) y trombocitopenia con monocitosis. En casos de nefropatía existe proteinuria. Es frecuente el hallazgo de pigmento en el interior de los monocitos.


Diagnóstico de laboratorio

     El diagnostico definitivo del paludismo esta basado en la demostración de los parásitos en la sangre. Se emplean dos tipos de preparaciones de sangre. La gota gruesa permite el examen de una mayor cantidad de sangre y se emplea como procedimiento de elección. Los frotis de sangre se preparan por lo general cuando el  paciente ingresa al hospital, después deben tomarse muestras cada 6  a 8 horas, por lo menos durante tres días consecutivos hasta identificar las formas parasitarias.

Antes de considerar un preparado como negativo, deben observarse 200 campos microscópicos. Si es posible los extendidos deben ser preparados con sangre tomada de la punta del dedo o del lóbulo de la oreja; la sangre debe fluir libremente.

Si no es posible tener contacto con el paciente y los extendidos son malos, se debe solicitar un tubo con sangre recién extraída (se recomienda EDTA como anticoagulante) y preparar los extendidos inmediatamente al recibir la muestra.

Para preparar un extendido grueso, colocar 2  a 3 gotas pequeñas de sangre, sobre una área de unos dos centímetros de diámetro. Continuar con la agitación durante 30 segundos, para evitar la formación de cordones de fibrina que podrían impedir la visualización de los parásitos después de la tinción. Si el extendido es demasiado grueso o el portaobjetos no ha sido bien  desgrasado, la sangre será arrastrada durante el proceso de coloración. Dejar secar a temperatura ambiente en una  área libre de polvo.


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No se debe calentar nunca un extendido grueso ya que el calor fijará la sangre y los eritrocitos permanecerán intactos durante la tinción, el resultado será la retención del colorante con la consiguiente dificultad para identificar los parásitos que pudieran estar presentes.

El extendido delgado se usa principalmente para la identificación de la especie del parásito, aunque el número de microorganismos por campo es mucho menor que en la gota gruesa.

Como regla general los extendidos deben ser teñidos lo más pronto posible, ya que una demora prolongada, provoca retención del colorante.  Las coloraciones empleadas, son de dos tipos. Uno incluye el fijador en combinación con el colorante de modo que la fijación y la tinción ocurren simultáneamente, la coloración de Wright es un ejemplo. La tinción de Giemsa representa el otro tipo en el cual el fijador y el colorante se aplican en forma separada, en consecuencia el extendido delgado debe ser fijado antes de la coloración.


Coloracion de Giemsa

El colorante de Giemsa se encuentra en el comercio como solución madre concentrada o como polvo para quienes prefieren prepararla por si mismos.

Cualquier infección parasitaria  presuntiva o los diagnósticos de fiebre de etiología a determinar exigen un examen manual de extendido de sangre.


Reactivos
1.- Solución madre de Giemsa:

Colorante de Giemsa en polvo certificado..........................................600 mg.
Metanol absoluto, certificado, neutro y  libre de acetona. ................... 50 ml.
Glicerina neutra, certificada.................................................................. 50 ml.

·         Moler proporciones muy pequeñas de colorante y de glicerina en un mortero y recoger las mezclas en un frasco de 500 o 1000 ml hasta completar la cantidad necesaria.

·         Tapar el frasco con un tapón de algodón, cubrir con un papel grueso y colocar en un baño de agua entre 55  60° C. durante dos horas, cuidando que el agua alcance el nivel del colorante.



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·          Agitar suavemente cada media hora.
·         Dejar enfriar y agregar el alcohol.
·         Usar una proporción del alcohol medido para lavar el mortero y agregarlo al frasco.
·         Conservar en una botella color caramelo.
·         Dejar reposar 2 a 3 semanas, filtrar antes de usar.


2.- Solución madre de tritón X-100 al 10 %:
Tritón X- 100...................................... 100 mg.
Agua destilada................................... 100 ml.


3.- Solución madre para el buffer:
a.- Solución de fosfato disódico:
     Fosfato disódico anhidro........................ 9.5 g.
     Agua destilada......................................1000 ml.

b.- Solución de fosfato monosódico:
      Fosfato monosódico..............................  9.2 g.
      Agua destilada......................................1000 ml.


4.- Agua con PH regulado: PH entre 7.0 a 7.2,  controlar con el medidor del PH.
    Solución de fosfato disódico........................61 ml.
    Solución de fosfato monosódico..................39 ml
    Agua destilada…........................................900 ml.


Usar para extendidos delgados o combinación de extendidos delgados y gruesos.
5.- Solución de tritón en agua con PH regulado:
    a.- Tritón al 0.01 %  -agua regulada-
        Solución madre de tritón X-100 al 10 %.............1 ml.
        Agua con PH regulado................................. 1000 ml.


Para extendidos gruesos usar:
b.- Tritón al 0.1 % -agua regulada                                    
       Solución madre de Tritón X-100 al 10 %.......... 10 ml.
      Agua con PH regulado……............................ 1000 ml.



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Procedimiento para extendidos delgados
1.- Fijar los extendidos de sangre en metanol absoluto (libre de acetona) durante 30 segundos.
2.- Dejar secar al aire.
3.- Sumergir los portaobjetos en una solución formada por una parte de solución madre de Giemsa (comercial o preparada a partir del colorante en polvo) en 10  a 50 partes de tritón agua regulada- (PH 7.0  a 7.2).
4.- Teñir durante 10  a 60 minutos  (ver nota mas adelante). La solución de trabajo debe ser preparada diariamente a partir de la solución madre.
5.- Sumergir los preparados brevemente en la solución de tritón  -agua regulada-.
6.- Escurrir colocando los portaobjetos en posición vertical y dejar secar al aire libre.

Nota.- Una buena regla general para recordar las diluciones y los tiempos de tinción es que si la solución colorante esta en dilución de 1:20, se debe teñir durante 20 minutos, si está a 1:30, durante 30 minutos, etc. Sin embargo deben ensayarse una serie de diluciones y tiempos de tinción para determinar la mejor relación   dilución y tiempo, para cada lote de solución colorante.


Procedimiento para extendidos gruesos.- El procedimiento a seguir para la coloración de extendidos gruesos, es el mismo que para extendidos delgados, omitiendo los dos primeros pasos.



Cuestionario

1.- Describa el ciclo vital de los Plasmodios.
2.- Describa las características morfológicas de los esquizontes maduros de Plasmodium falciparum.
3.- Describa las características morfológicas de los trofozoítos de Plasmodium falciparum.
4.- Mencione dos diferencias morfológicas entre los esquizontes maduros de Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax.
5.- ¿ Cuales son las especies de Plasmodios que producen Paludismo terciano benigno ?.
6.- ¿ Cual es la especie de Plasmodium que produce Paludismo terciano maligno ?.
7.- ¿ Cual es la especie de Plasmodium que produce Paludismo cuartano ?.              
8.- Mencione el sitio y la técnica para la obtención de sangre para los frotis.
9.- Mencione la técnica para hacer el frotis de un extendido delgado.
10.- Describa  la técnica de tinción con colorante de Giemsa en frotis delgados,



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Práctica No. 12

TRIPANOSOMIASIS


Objetivos.


1.- El alumno conocerá las características morfológicas de las especies del género Tripanosoma.

2.- El alumno conocerá el ciclo biológico de las especies del género Tripanosoma.

3.- El alumno identificará por microscopia la morfología de las especies del género Tripanosoma.

4.- El alumno conocerá los medios de cultivo útiles para el aislamiento de las especies del género Tripanosoma.

5.- El alumno conocerá el xenodiagnóstico como método diagnóstico.







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Tripanosomiasis

La Tripanosomiasis es una enfermedad producida por protozoarios parásitos de la sangre y los tejidos de peces, anfibios, reptiles, insectos, aves y mamíferos que incluyen al hombre. Tripanosoma rhodesiense, Tripanosoma gambiense y Tripanosoma cruzi son las especies del género Tripanosoma que afectan al hombre.

A  una úlcera inicial que aparece posterior a la picadura de la mosca Tsé Tsé  seguirán fiebre persistente hasta por una semana, adenopatía generalizada, edema, signo de Romaña (T. Cruzy) como signos característicos de la enfermedad. La  anemia y la infiltración encefálica producen astenia y  alteraciones al estado de consciencia como letargo y estupor de ahí su nombre “la enfermedad del sueño”, la insuficiencia renal, la miocarditis y el coma ocasionan la muerte.


Clasificación

Los Tripanosomas pertenecen al phylum Sarcomastigophora.- Los miembros de este phylum se caracterizan por poseer un único núcleo,  cuando existe sexualidad es por singamia , la movilidad es conferida por flagelos, pseudópodos, o por ambos. El Phylum sarcomastigospora incluye a su vez tres subphylos; Mastigophora Opalinata y Sarcodina. El subphylum Mastigophora agrupa organismos cuyas formas adultas o trofozoitos poseen uno o más flagelos, su reproducción asexual se produce por fisión binaria, su reproducción sexual no es bien conocida.

El subphylum Mastigophora incluye a su vez dos clases Phytomastigophora y Zoomastigophora, este último subphylum agrupa a cinco órdenes, uno de ellos, Kinetoplástida incluye a un suborden, Tripanosomatina cuyos miembros se caracterizan por poseer un flagelo libre o fijo al cuerpo provisto de una membrana ondulante.

El género tripanosoma del Orden Kinetoplástida incluye a tres especies patógenas para el hombre Tripanosoma gambiense, Tripanosoma rhodesiense (Africa central) y Tripanosoma cruzi (Centro y Sudamérica). El género Trypanosoma se caracteriza por utilizar a dos tipos de huéspedes para completar su ciclo de vida, uno vertebrado y otro invertebrado.

  Los tripanosomas que causan en Africa la enfermedad del sueño T. Gambiense y  T. rhodesiense,  son transmitidos por vector, existen por lo menos 22 especies de moscas Tsé Tsé hematófagas del género Glossina,  la mayoría obtienen su alimento de animales salvajes y del hombre propagando la parasitosis.



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  Tripanosoma gambiense produce la enfermedad del sueño en el centro y occidente de Africa, Senegal, Angola, Zaire y el Congo. La mosca Tsé Tsé (Glossina morsitans) hematófaga infectada,  transmite la enfermedad cuando pica al humano para chupar la sangre, depositando las formas metacíclicas del Tripanosoma que invade los tejidos hemático-linfáticos, bazo, hígado, sangre, riñón, encéfalo multiplicándose y produciendo una parasitemia .

La invasión de los tejidos produce un reacción inflamatoria intensa con infiltración de monocitos, macrófagos, linfocitos, células plasmáticas con infiltración perivascular y proliferación degenerativa de células endoteliales. El líquido céfalorraquídeo de aspecto turbio y con abundantes parásiros aumenta su volumen ocasionando edema cerebral.  Cefalea intensa, somnolencia, letargo, crisis convulsivas, ilusiones, alucinaciones, trastornos del equilibrio y la falta de coordinación de movimientos voluntarios son signos que se presentan antes del coma y son de mal pronóstico.
           
Tripanosoma rhodesiense es endémico en Tanzania y Uganda, es el agente causal de la enfermedad del sueño rápidamente mortal, no es raro que el enfermo muera durante el periodo de incubación, es decir, antes de las manifestaciones neurológicas.

Trypanosoma brucei es una especie incapaz de producir la enfermedad en el hombre en condiciones naturales, sin embargo la enfermedad se hace evidente en inmunocomprometidos. T. Brucei afecta al ganado salvaje como antílopes, en el ganado vacuno la enfermedad es mortal de ahí el nombre de Nagana.

Tripanosomiasis Americana, Enfermedad de Chagas o Romaña Mazza es causada por Tripanosoma cruzi, protozoario intracelular del Sistema Retículo Endotelial e invade particularmente endocardio, tubo digestivo y Sistema Nervioso central. Las lesiones se caracterizan por destrucción de células grasas que dan origen a lipogranulomas.

 La Tripanosomiasis Americana se limita geográficamente desde el sur de México hasta el norte de Argentina. La enfermedad es transmitada de mamíferos salvajes, como zarigüeyas (Tlacuaches), mapaches y ratas al hombre mediante las heces fecales de  chinches, vectores artrópodos del orden Hemíptera, de la familia Reduvidae, Sub-familia Triatominae con 16 géneros y 114 especies. Triatominae  Infestans es el más importante desde el punto de vista epidemiológico. Estos insectos se encuentran en las grietas de casas rurales construidas con ramas de palma, madera, barro, etc., y salen durante la noche para alimentarse mientras el  hombre duerme.


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La infección puede adquirirse a través de transfusiones sanguíneas, transplante de órganos o por vía transplacentaria de madre a feto.  La infección se adquiere también por la ingesta de alimentos contaminados. Los mamíferos que actúan como reservorio frecuentemente adquieren la enfermedad al comer chinches infectadas.


Ciclo biológico

Estas chinches se infectan al picar y chupar la sangre a un animal infectado, ingiriendo así al parásito (en su estadio de tripanosomas). Dentro de la chinche y a lo largo de su tracto digestivo, el parásito sufre una serie de transformaciones antes de ser expulsado en las heces.

 En el estómago del insecto, los tripanosomas se redondean formando amastigotes, a mitad de su intestino se transforman en epimastigotes que se replican mediante fisión binaria y finalmente, aproximadamente 2 semanas después, llegan al recto, donde se convierten en tripanosomas metacíclicos listos para ser expulsados.

La infección  en los mamíferos se inicia cuando un insecto infectado defeca mientras se alimenta, liberando tripanosomas metacíclicos en sus heces. Los tripanosomas, incapaces de atravesar la piel intacta, entran al organismo a través de excoriaciones de la piel (sitio de la mordedura o picadura), invadiendo inmediatamente a histiocitos o monocitos, ya dentro de estas células, los tripomastigotes pierden su flagelo y se redondean adquiriendo una nueva morfología parasitaria,  amastigotes, que se multiplican intracelularmente por fisión binaria.

 Los amastigotes maduran intracelularmente y se transforman en tripomastigotes, los cuales son liberados a los espacios intersticiales y al torrente sanguíneo, rompiendo la célula. Los tripomastigotes tienen la habilidad de invadir otras células, dónde se transforman de nuevo en amastigotes, repitiéndose indefinidamente el ciclo de infección. El ciclo de vida se cierra cuando un triatómino se alimenta de un animal con tripanosomas en la  circulación periférica.

T. cruzi es un protozoo flagelado de 7 a 20 micras, cuyas características morfológicas varían según  la fase biológica en que se encuentre. La forma de tripanosoma se observa sólo en la sangre circulante,  sin embargo no se multiplica en ella, a diferencia de los tripanosomas africanos.

Los parásitos infectan a  todo tipo de células nucleadas,  con  marcada preferencia por células musculares cardiacas, macrófagos, neuronas y tejido glial.



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La destrucción de las células parasitadas da inicio a una intensa respuesta inflamatoria ocasionando miocarditis aguda, meningoencefalitis con destrucción de ganglios en el tracto gastrointestinal.

La respuesta inmune celular y  humoral hace que descienda  el número de parásitos en sangre y en los tejidos a niveles tan bajos, que en ocasiones no es posible detectar a los parásitos con los métodos usuales de diagnóstico como en las tinciones con Giemsa en las muestras de sangre periférica.

Algunas  personas pueden ser portadores asintomáticos y el daño tisular se limita a pequeños focos de inflamación  con fibrosis y pérdida limitada de tejido  ganglionar. En los casos de cardiopatía Chagásica severa, hay destrucción importante de las células musculares cardiacas y del tejido de conducción con fibrosis difusa e infiltrado inflamatorio.


Cuadro clínico

El periodo de Incubación es de 1 a 2 semanas (4-12 días) y el cuadro clínico se divide en fases: Aguda, latente y crónica.

Fase aguda

·         Más frecuente en niños, dura de 2 a 4 meses, se presenta el signo de (Romaña-Mazza) que consiste en un edema bipalpebral, unilateral, con adenopatías, con tono púrpura, conjuntivitis.

·         Chagoma de inoculación.- Nódulo linfocutáneo, durante la parasitosis y diseminación.

·         Fiebre, cefalea, anorexia, malestar general, vómito, diarrea, mialgias, artralgias, anasarca.

·         Miocarditis aguda.- Taquicardia, insuficiencia biventricualr, acompañada por derrame pericárdico que evoluciona a insuficiencia cardiaca congestiva, de instalación súbita y curso violento.

·         Meningoencefalitis, se limita a los niños y casi siempre es mortal, el pronóstico en la fase aguda generalmente es bueno, remite espontáneamente, la globulina aumenta y la albúmina disminuye.



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Fase latente o indeterminada

A esta fase también se lo conoce como subclínica o infección chagásica.
·         Desaparece la sintomatología.
·         Serología (+); estudios de Electrocardiograma y Rayos X sugestivos de endocarditis o bien normales.


Fase crónica

·         Inicio de síntomas de enfermedad progresiva, taquicardia, palpitaciones, arritmias ventriculares, dolor precordial leve sin síncope, fibrilación, bloqueo A-V total o parcial, bloqueo completo de la rama derecha del haz de his, etc.
·         Megacolon: flatulencia, estreñimiento, asas dilatadas,  colecistitis.
·         Megaesófago: disfagia, odinofagia, pirosis, eructos, dolor torácico, sialorrea.
·         Sistema Nervioso Central, se ha atribuido la pérdida de los reflejos tendinosos profundos.


Tripanosomiasis congénita: Puede causar aborto o infección congénita, daño neurológico progresivo, hemorragias cutáneas y alteraciones del EKG (mortalidad del 50%).



Morfología e identificación

Tripanosoma gambiense se encuentra principalmente en sangre humana en  forma adulta o tripomastigote y mide entre 14 a 33 micras de largo por 1.5 a 3.5 micras de ancho. En las preparaciones teñidas con el método de Giemsa, el citoplasma se tiñe de color azul pálido, contiene vacuolas y gránulos de volutina (material glucoproteico) que se tiñen azul oscuro.

El núcleo de posición central se tiñe de color rojo púrpura, en preparaciones fijadas con hematoxilina, se puede distinguir la membrana nuclear y el cariosoma central.

El Kinetoplasto situado en el extremo posterior al núcleo formado por un corpúsculo parabasal y el blefaroblasto aparecen como dos pequeñas manchas de color azul rojizo.




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La membrana ondulante se tiñe de azul pálido esta se origina en el blefaroblasto pasa por arriba y adelante del núcleo y termina en el borde anterior del citoplasma, desde donde se extiende hacia el extremo libre formando el flagelo.



Los tripomastigotes de Tripanosoma rhodesiense miden entre 15 y 30 micras de largo por 1.5 a 3.5 micras de ancho, sin embargo, morfológicamente estas dos especies son indistinguibles entre sí.

La morfología de Tripanosoma cruzi se puede estudiar en preparaciones fijas con técnica de Giemsa, en el huésped mamífero se encuentra en sangre periférica principalmente en  dos etapas de su ciclo vital, tripomastigoto y amastigoto.

Los tripomastigotes de T. Cruzi adoptan la forma de la letra C, miden de 7 a 20 micras de largo, su citoplasma se tiñe de azul pálido, el núcleo central y el Kinetoplasto posterior se tiñen de color rojizo púrpura. La raíz del flagelo nace en blefaroplasto y se extiende por el borde de la membrana ondulante que alcanza el extremo anterior y sale como flagelo libre en el extremo anterior.

  Durante el ciclo vital de estos parásitos es posible encontrar diferentes formas parasitarias que atendiendo al lugar de origen del flagelo es posible identificar los siguientes tipos morfológicos, empleando la nonmenclatura de Guayasse (1966) y completada por Brack (1968).

Amastigote.- Cuerpo redondeado con cinetoplasto, gránulo basal y el flagelo reducido a una pequeña porción.



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Promastigote (leptomona).- Cuerpo alargado núcleo central y flagelo anterior.
Epimastigote (critidia).-  Gránulo basal situado arriba del núcleo.
Tripomastigote metacíclico.- Parásito intracelular en diferente tejido, corazón, músculo esquelético, sistema nervioso central, tubo digestivo, tejido glandular.


El diagnóstico se basa en la demostración de los parásitos en sangre mediante microscopía con tinción de Giemsa. El aislamiento de los  parásitos en los medios de cultivo NNN, Nagashi-Nakamura, Kenser, Warren se utilizan cuando el examen microscópico resulta negativo.

Un método eficaz para aislar T. cruzi es el xenodiagnóstico en este método se utilizan chinches sanas, triatóminos de laboratorio que se alimentan de la sangre del paciente, posteriormente, 4 semanas después las heces de la chinche y su contenido intestinal es examinado en búsqueda de los  parásitos.  El diagnóstico puede establecerse también demostrando anticuerpos específicos de tipo IgM o que los títulos de anticuerpos específicos IgG se cuadripliquen.


Cuestionario.

1.- Describa  el ciclo biológico de las especies del género Tripanosoma.
2.- Describa las características morfológicas de amastigotes de las especies del género Tripanosoma.
3.- Describa las características morfológicas de Trypomastigotes de las especies del género Tripanosoma.
4.- Describa las características morfológicas de Trypomastigotes de  T. Cruzi.
5.- ¿Qué es el Xenodiagnóstico?



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 Práctica No. 13


            HEMOCULTIVO



Objetivos.

1.- El alumno conocerá la importancia del hemocultivo como método para el diagnóstico etiológico y tratamiento de las septicemias y fiebres de origen desconocido.

2.- El alumno conocerá a los microorganismos que se aíslan con mayor frecuencia en los hemocultivos.

3.- El alumno aplicará la técnica para la toma de la muestra para el hemocultivo.

4.- El alumno aplicará la técnica para hacer un hemocultivo.

5.- El alumno interpretará los resultados positivos o negativos de un hemocultivo.









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Introducción

La septicemia y el shock séptico son síndromes clínicos espectaculares que se deben a la invasión aguda del torrente sanguíneo por ciertos microorganismos y/o sus toxinas. Las manifestaciones ordinarias de la septicemia aguda son: escalofrío, fiebre,  taquicardia, taquipnea,  alteraciones mentales y otros síntomas generales.

 Cuando aparece hipotensión y signos de riego sanguíneo insuficiente a órganos y sistemas, el proceso se denomina shock séptico.

La insuficiencia circulatoria que acompaña al shock séptico, se caracteriza por una resistencia vascular muy disminuida, descenso de la función contráctil del miocardio, estancamiento y mala distribución de la sangre en la micro circulación, aparecen lesiones celulares y tisulares difusas (coagulación intravascular  diseminada CID) y finalmente el fracaso generalizado de los órganos lleva a la muerte.

Las manifestaciones de septicemia, pueden verse en infecciones sistémicas graves, ocasionadas por un gran número de microorganismos, sin embargo, el shock séptico franco se debe a bacterias Gram negativas, (E. coli, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas) hasta en un 65% del total de los casos y un 30% se debe a bacterias Gram positivas (Staphylococcus, Streptococcus piogenes, S. viridans y S. pneumoniae principalmente).

Actualmente se calcula que en Estados Unidos la incidencia de bacteriemia tan solo por bacilos Gram negativos, se encuentra alrededor de 500,000 casos anuales.

Entre los principales factores de riesgo que conducen a una septicemia se encuentran: Diabetes mellitus, cirrosis hepática, alcoholismo, leucemia, cáncer, quimioterapia citotóxica, fármacos inmunosupresores, técnicas quirúrgicas (apendicectomía), colecistectomía, cesárea, aborto, etc.), infecciones de tubo digestivo, aparato urinario, heridas y quemaduras infectadas.

A pesar de un tratamiento con antimicrobianos adecuados muchos enfermos mueren de shock séptico, la tasa de mortalidad por septicemia producida por bacilos Gram negativos es  del 25% del total de los casos y el total de muertes producidas por bacilos Gram positivos es del 10%.

Dado que la bacteriemia con frecuencia augura un padecimiento que pone en peligro la vida, la detección oportuna del agente etiológico es esencial.



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El hemocultivo es el procedimiento sencillo más importante que se hace en el laboratorio de microbiología para identificar a los géneros y especies bacterianas causantes de septicemia,  este método es esencial en quien se sospeche de una endocarditis infecciosa, aun en el caso de que el paciente no muestre indicios de un padecimiento agudo o de gravedad. Además de su significado en el diagnóstico, el aislamiento del agente infeccioso de la sangre constituye una ayuda inapreciable en la determinación del tratamiento antimicrobiano. Por lo tanto, en la bacteriemia deberán efectuarse todos los esfuerzos posibles para aislar el microorganismo causal.

En personas sanas, las muestras obtenidas de manera apropiada son estériles. Aunque en ocasiones los microorganismos de la flora normal respiratoria y gastrointestinal pasan a la sangre, son eliminados con rapidez por el sistema retículo endotelial. Estos microorganismos transitorios rara vez interfieren en la interpretación de resultados. Si el hemocultivo revela microorganismos, este hecho es de sumo interés clínico siempre y cuando puedan excluirse los errores técnicos.

La contaminación de los hemocultivos  con flora cutánea normal  se debe comúnmente a errores durante la recolección, por consiguiente, se requiere una técnica apropiada en este procedimiento.

Se debe hacer uso de un equipo estéril y técnicas asépticas apropiadas. La piel debe ser limpiada con tintura de yodo al 2% en círculos que se irán ensanchando desde el sitio propuesto para la punción. El exceso de yodo se elimina con alcohol a un 70%. Deben extraerse 20 mL de sangre, los cuales deben inocularse en frascos estériles con medios para cultivo anaerobio y aerobio. Deben incubarse a 37°C.

Varios factores determinan si los hemocultivos producirán resultados positivos, por ejemplo el volumen de sangre cultivada, su dilución en el medio de cultivo, el uso de medios de cultivo aerobio y anaerobio y el tiempo de incubación.

Para adultos por lo general se obtienen 20 mL de sangre, una mitad se coloca en un frasco de hemocultivo para aerobios y la otra en uno para anaerobios, comprendiendo ambos un solo hemocultivo. Sin embargo, es posible que se requieran volúmenes diferentes para los numerosos sistemas de hemocultivo que existen.

Un sistema de hemocultivo de uso extenso usa botellas que contienen 5 ml de sangre en vez de 10 ml.  La mayor parte de los medios usados, contienen 0.05% de polianetol sulfonato de sodio (SPS), que inhibe la proliferación de neisserias, cocos anaerobios Gram negativos y Gardnerella vaginalis.



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Si se sospecha la presencia de cualquiera de estos microorganismos, deberán utilizarse sistemas alternativos para hemocultivo que no contengan SPS.

Los hemocultivos se incuban durante cinco a siete días a menos que sea indicado específicamente por el médico que puede estar presente un patógeno de crecimiento lento (por ejemplo, Brucella).

En sistemas manuales los frascos para hemocultivo son examinados dos a tres veces al día durante los primeros dos días y diariamente después durante una semana. Los sistemas de hemocultivo automático usan una diversidad de métodos para detectar cultivos positivos: detección de CO2 por espectroscopia infrarroja, detección colorímetra de cambios de pH, detección fluorométrica  de productos metabólicos y detección  electrónica de cambios de presión. Estos métodos automatizados permiten la vigilancia frecuente de los  cultivos y la detección temprana de los positivos en comparación con los métodos manuales. Muchos laboratorios subcultivan regularmente cultivos de sangre para detectar organismos que  no son visibles y que no han sido detectados por el sistema automatizado.

El número de muestras de sangre que deben extraerse  y el periodo durante el cual  deberá hacerse  dependen en parte de la gravedad del padecimiento clínico. En las infecciones hiperagudas, por ejemplo,  septicemia  por Gram negativos con choque  o septicemia por estafilococos, es apropiado cultivar dos muestras de sangre obtenida de sitios anatómicos distintos en un periodo de 10 minutos. En otras infecciones bacteriémicas, por ejemplo, endocarditis, deberán obtenerse tres muestras  durante el lapso que va desde  algunas horas hasta 24 horas. Un total de tres hemocultivos descubren  la bacteria infectante en más del 95 % de los pacientes bacteriémicos. Si los tres cultivos iniciales son negativos   y se sospecha de un absceso oculto, fiebre de origen desconocido o alguna otra infección obscura, deben cultivarse muestras adicionales antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos.

Se obtiene una proporción más elevada de resultados positivos cuando se toma la muestra durante un acceso febril.

Se dispone de frascos para hemocultivo que contienen resinas que absorben una gran parte de los antimicrobianos así como factores antimicrobianos del huésped.

Las indicaciones para el uso de frascos con resina son las siguientes:

1.    Pacientes sépticos que están recibiendo  terapéutica con antimicrobianos cuyos hemocultivos ya han dado resultados negativos.



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2.    Pacientes con datos clínicos de endocarditis y hemocultivos negativos  y que esta recibiendo terapéutica con antimicrobianos.

3.    Pacientes admitidos en el hospital con sepsis a los que se les ha administrado antimicrobianos antes de la admisión.

Los frascos que contienen resina no deberán usarse para seguir la eficacia del tratamiento debido a que la resina puede absorber los antimicrobianos de la muestra y permitir  que el cultivo se vuelva positivo a pesar de la eficacia clínica del tratamiento.

Es necesario determinar  el significado de un hemocultivo positivo. Los siguientes criterios pueden ser útiles para diferenciar las muestras “positivas verdaderas" de las  contaminadas:

·         La proliferación del mismo microorganismo en cultivos repetidos, obtenidos en diferentes momentos de sitios anatómicos separados, es muy sugestiva de bacteriemia verdadera.
·         La proliferación de microorganismos diferentes en frascos de cultivo distintos  sugiere contaminación, pero en ocasiones puede representar problemas clínicos como fístulas enterovasculares.
·         La proliferación de la flora cutánea normal, por ejemplo Staphylococcus epidermidis, difteroides (corinebacterias y propionebacterias) o cocos anaerobios Gram positivos, en solo uno de varios cultivos, sugiere contaminación. Su proliferación en más de un cultivo o en muestras de un paciente con prótesis vascular, incrementa la probabilidad de bacteriemia con significado clínico.
·         La proliferación de microorganismos como los Streptococcus viridans o los enterococcus es probable en los cultivos de pacientes en quienes se sospeche de endocarditis y la de bacilos Gram negativos como E. coli en los cultivos de enfermos  con septicemia por Gram negativos; por tanto es lógico que el encontrar estos microorganismos esperados tenga importancia etiología.

Casi todas las especies han proliferado  en los hemocultivos en algún momento.

La mayor parte de los hemocultivos han dado resultados positivos a partir  de su fórmula, los medios enriquecidos generalmente contienen infusión de cerebro y corazón adicionado de Agar, ácido paraaminobenzoico o penicilinasa. Estos medios permiten el crecimiento de bacterias tanto aerobias como anaerobias. El ácido paraaminobenzoico y la penicilinasa anulan el efecto bacteriostático y bactericida de Sulfas y penicilinas.



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Los siguientes microorganismos son los que se encuentran con mayor frecuencia en los hemocultivos:

Staphylococcus, incluyendo Staphylococcus aureus.
Estreptococos viridans.
Enterococcus, incluyendo Enterococcus feacalis.
Bacterias entéricas Gram negativas, incluyendo E. coli, S. tiphy.
Brucellas.
Klebsiella pneumoniae.
Pseudomona aeruginosa.
Diplococcus pneumoniae.
H. influenzae.
Especies de Cándida.
Otras levaduras y  algunos otros hongos bifásicos, como Histoplasma capsulatum.

En la mayor parte de los tipos de bacteriemias, no es útil el examen directo de frotis sanguíneos.

Las indicaciones para la obtención  de cultivos de sangre son múltiples, pero básicamente lo son; un cambio súbito de la frecuencia del pulso y la temperatura, acompañado o no de escalofríos, postración  e hipotensión; una historia de fiebre leve, intermitente y persistente, asociada con un  soplo cardiaco y generalmente cualquier sospecha  de sepsis.

La bacteriemia suele ser intermitente, con la notable excepción de la asociada a la endocarditis que es constante, por esto es indispensable que se realicen más de un grupo de cultivos.  La sangre debe tratarse contra la coagulación en el tubo de transporte o en el medio de cultivo mismo. 

En ausencia de pruebas macroscópicas de crecimiento, debe llevarse a cabo un subcultivo rutinario de la botella aeróbica entre 6 y 18 horas después,  inoculando la mezcla de sangre-caldo  en agar sangre y agar chocolate incubando  a 35° C, en una atmósfera de CO2 al 5-10% durante 48 horas.

Material para la práctica

1 frasco con medio de cultivo Ruiz Castañeda.
1 Jeringa estéril de 10 ml.
1 Ligadura.
Torundas con alcohol etílico al 70 %.
Mechero de Bunsen.





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Método

Se debe hacer uso de equipo estéril y técnicas asépticas apropiadas

1.-  Aplicar una ligadura en el tercio medio del brazo seleccionado.

2.- Localizar por inspección y palpación la vena cubital intermedia a nivel del pliegue anterior de la articulación del codo.

3.- La piel debe ser limpiada con tintura de yodo al 2 % en círculos que se irán ensanchando desde el sitio propuesto para la punción. El exceso de yodo se elimina con alcohol etílico al 70 %.

4.- Realizar la punción en la vena cubital extrayendo sangre para asegurarse de que la punción sea correcta.

5.- Retirar la ligadura.

6.- Extraer por lo menos 10 ml de sangre para inocularse en frascos estériles con medio de cultivo para aerobios y anaerobios, 5 ml de sangre respectivamente. La muestra para el medio bifásico (agar sólido y medio líquido) Ruiz Castañeda, será de 3 ml para efecto de la práctica.

7.- Retirar la tapa metálica de rosca del medio Ruiz Castañeda.

8.- Con la jeringa que contiene la muestra de sangre, hacer una perforación en la tapa de goma, para depositar la muestra en el medio Ruiz castañeda.

9.- Agitar el frasco lentamente, durante 10 segundos.

10.- Colocar el frasco en posición horizontal durante 30 minutos, para que la muestra quede en contacto con la parte sólida del medio de cultivo.

11.- Enderezar el frasco e incubar a 37° C.

12.- Observar cada 24 horas.

Interpretación

En el medio sólido el resultado es positivo cuando hay crecimiento colonial.
En el medio líquido el resultado es positivo cuando es de aspecto turbio.



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Nota

 En caso de resultados positivos, los medios de cultivo se deben conservar en incubación para resembrar posteriormente en medios selectivos y a partir de estos últimos hacer pruebas bioquímicas para la identificación de género y especies patógenas.









Cuestionario.


1.- ¿Cuales son las indicaciones para realizar  hemocultivos?

2.- ¿Cuántos hemocultivos indicaría Usted en caso de septicemia?

3.- Mencione en orden de importancia a las 8 especies bacterianas que se aíslan con mayor frecuencia en los hemocultivos.

4.- Describa la técnica para la toma de la muestra.

5.- Describa la técnica para la siembra en el medio Ruiz Castañeda.



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 Práctica No. 14

RESIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

Objetivos

1.- El alumno conocerá a los géneros y especies bacterianas capaces de producir bacteriemias, septicemias y shock séptico.

2.- El alumno conocerá los medios de cultivo selectivos útiles para el aislamiento de los microorganismos que con mayor frecuencia producen bacteriemias, septicemias y shock séptico.

3.- El alumno conocerá el fundamento de la selectividad de los medios de cultivo.

4.- El alumno sembrará con técnica de aislamiento en los medios de cultivo agar chocolate, agar S110, agar EMB, agar Mc Conkey y agar Biggy a partir de cultivos puros.

5.- El alumno interpretará y reportará por escrito las características morfológicas coloniales de los cultivos positivos.

6.- El alumno aplicará la técnica de tinción de Gram a partir de los cultivos positivos.

7.- El alumno reportará por escrito las características morfológicas y de tinción de las observaciones al microscopio de luz.







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Introducción

Los hemocultivos como medios generales o enriquecidos permiten el crecimiento de un gran número de microorganismos sin embargo, el aislamiento definitivo de un microorganismo bacteriano en un cultivo puro representa un serio problema tomando en cuenta que cada uno de estos microorganismos requiere de un ambiente en el cual se encuentren los elementos mínimos necesarios para su desarrollo, evitando a la vez el crecimiento de otros géneros bacterianos. Para tal efecto se dispone de varios métodos.

A diferencia de los microorganismos que se multiplican con gran facilidad en los medios líquidos enriquecidos como el hemocultivo, caldo con cerebro corazón, extractos de carne etc., las bacterias que crecen sobre o dentro de un medio sólido, se encuentran relativamente inmóviles, por consiguiente, si algunas de estas bacterias se coloca en un medio gelificado, cada una crece y da origen a un colonia aislada. Por lo anterior, el Gel ideal  para la mayor parte de medios de aislamiento selectivo es el Agar, al que se le adicionan elementos nutritivos especiales para el crecimiento de algunos géneros bacterianos.

El crecimiento de organismos no deseados se puede inhibir utilizando algunas substancias como el azul de metileno,  sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio, etc. La técnica de siembra usada (generalmente por estría cruzada) y el medio  de cultivo seleccionado dependen del microorganismo a investigar.

Tomando en cuenta que los microorganismos que aíslan con mayor frecuencia en los hemocultivos son: Staphylococcus epidermidis,  Staphylococcus aureus, Estreptococos viridans, Enterococcus, incluyendo Enterococcus feacalis, Bacterias entéricas Gram negativas como Escherichia  coli, Salmonella tiphy, Brucellas, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, Diplococcus pneumoniae, H. influenzae, Cándida, etc., los medios de cultivo útiles para tal fin son:

·         El Agar S110, es un medio selectivo para  S. aureus porque es capaz de soportar concentraciones de cloruro de sodio, de hasta 9 %, que inhiben el crecimiento de otras bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas.

·         El Agar Sal manitol con rojo de fenol es un medio altamente selectivo para  Staphylococcus aureus único en su género que tiene la capacidad de fermentar manitol y cambiar la coloración del medio de rojo normal, a amarillo, cuando hay producción de ácido, como resultado de la degradación de  este carbohidrato., este cambio de coloración se debe al indicador de Ph rojo de fenol.




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·         El Agar sangre de carnero es un medio selectivo para Streptococcus beta hemolíticum, en este medio de cultivo se evidencian sus reacciones hemolíticas  observándose la beta hemólisis como un halo completamente transparente alrededor  o por debajo de las colonias.

·         El Agar sangre se recomienda para el aislamiento de Streptococcus pneumoniae,  la alfa hemólisis que producen estos microorganismos se observa como un halo verdoso alrededor de las colonias del medio. Es necesario hacer pruebas complementarias como la lisis bacteriana con desoxicolato o bilis de buey así como la tinción de cápsula con tinta china.

·         El Agar  chocolate se utiliza como medio selectivo para el aislamiento de Haemophylus influenzae, estos microorganismos requieren de los factores V y X de la sangre para su crecimiento. El Agar sangre humana o de cordero inhiben el crecimiento de Haemophylus. Los microorganismos típicos son cocobacilos Gram negativos con cápsula, de 1.5 micras de largo por .5 micras de diámetro

·         Agar Sabouraud glucosado.- Con este medio de cultivo es posible estudiar a un gran número de infecciones causadas por  hongos, contiene, glucosa, Agar, y peptona, el medio puede contener 20 unidades de penicilina o 40 microgramos de estreptomicina o bien 50 microgramos de cloranfenicol por cada mililitro que inhiben el crecimiento de bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas aerobias o anaerobias,  inhiben también el crecimiento de algunos hongos como Aspergillus y Cryptococcus, por lo que pueden utilizarse otros medios como Agar de papa glucosado, Agar harina de maíz, etc.

La familia enterobacteriaceae  (bacterias entéricas), está formada por un grupo heterogéneo de bastoncillos Gram negativos que residen de manera natural en el tubo digestivo del hombre. En esta gran familia Enterobacteriaceae  se han incluido a mas de 20 géneros y 100 especies, los géneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Pseudomonas  son capaces de producir septicemias mortales. 

Para la identificación preliminar de los géneros de esta gran familia, se recurre  a la observación de las características morfológicas de sus colonias aisladas en medios selectivos como:

·         Agar Mac Conkey.- Se emplea para el aislamiento de las especies patógenas de organismos coliformes. La inhibición de bacterias Gram positivas se obtiene mediante la mezcla de sales biliares a este medio. El Agar Mac Conkey es un medio selectivo para el aislamiento de enteribacterias Gram negativas.


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·         Eosina y azul de metileno. Este medio es útil para el aislamiento y diferenciación de los bacilos entéricos Gram negativos. El colorante Azul de metileno inhibe el crecimiento de otros organismos.

·         El Agar SS,  para Salmonellas y Shigellas es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacilos entéricos patógenos, especialmente para los géneros Shigella y Salmonella. La  inhibición de los organismos Gram positivos se logra con más éxito con la mezcla de sales biliares que contiene este medio.


Material

1 Medio de cultivo Ruiz Castañeda,  previamente inoculado (práctica anterior).
1 Medio de cultivo Agar  sangre.
1 Medio de cultivo Agar chocolate.
1 Medio de cultivo Agar S110.
1Medio de cultivo EMB
1 Medio de cultivo con Agar Biggy
Asa bacteriológica.
Mechero de Bunsen.


Método

·         Tomar una asada de una de las colonias que desarrollaron en el medio sólido del medio Ruiz Castañeda y sembrar  con técnica de aislamiento en los medios de cultivo:

Agar sangre
Agar chocolate
Agar S110
Agar EMB

            Se debe tomar una asada para sembrar en cada uno de los medios de cultivo especificado. En el caso de que no hubiera crecimiento en la fase sólida pero en la fase líquida hubiese indicios de desarrollo bacteriano, se procederá de la misma forma para sembrar en los medios de cultivo.

·   Incubar a 37 ° C.
·   Observar  los resultados cada 24 horas.




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·         Los medios de cultivo Agar sangre y S110 deberán mantenerse en refrigeración después de 24 horas para que se encuentren en buen estado para que en la siguiente práctica se realice  una tinción de Gram y las pruebas bioquómicas pertinentes para la identificación del género y especie bacteriana.


·         Los medios de cultivo Agar chocolate y EMB deben incubarse a 37° C. Durante 48 horas para observar el crecimiento bacteriano. Una realizada la descripción de la morfología colonial, los cultivos deberán de mantenerse en refrigeración para continuar con  los procedimientos de identificación de géneros y especies por pruebas bioquímicas en la próxima sesión.





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Cuestionario.


1.- ¿Qué es una septicemia?

2.- ¿Cuál es la diferencia entre bacteriemia y septicemia?

3.- Mencione a los géneros y especies de bacterias Gram positivas que se aíslan con mayor frecuencia en pacientes sépticos?

4.- Mencione a los géneros y especies de bacterias Gram negativas que se aíslan con mayor frecuencia en pacientes sépticos?.

5.- Explique  el fundamento de la selectividad del medio de cultivo agar Sangre.

6.- Explique  el fundamento de la selectividad del medio de cultivo agar Chocolate.

7.- Explique  el fundamento de la selectividad del medio de cultivo agar S 110.

8.- Explique  el fundamento de la selectividad del medio de cultivo agar EMB.

9.- ¿Qué microorganismos se pueden aislar en el medio de cultivo Biggy?

10.- Describa la técnica de aislamiento también llamada estría cruzada.



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Práctica 15

IDENTIFICACIÓN DE GENEROS Y ESPECIES BACTERIANAS POR PRUEBAS BIOQUIMICAS.


Objetivos

1.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons.

2.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en el medio de cultivo líquido Caldo con urea o en el medio sólido Agar con urea de Christensen.

3.- El alumno aplicará las técnicas de siembra en tubos para los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons y agar con urea de Christensen de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

4.- El alumno aplicará la técnica de siembra en tubos para el medio de cultivo líquido Caldo con urea de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

5.- El alumno interpretará las pruebas positivas y reportará a los géneros y especies bacterianas identificadas como posibles patógenas.







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            Una vez obtenidos los cultivos puros en medios selectivos a partir del hemocultivo, se deben realizar pruebas bioquímicas para la identificación de los géneros y especies patógenas aisladas. La elección de las pruebas bioquímicas y los medios de cultivo diferenciales dependen del microorganismo en estudio.

            Las características morfológicas de las colonias en el medio de cultivo selectivo en el que hubo crecimiento así como las características morfológicas a la  tinción de Gram de los microorganismos, son la base para el inicio de un protocolo para la diferenciación de género y especie de bacterias Gram positivas o Gram negativas, aerobias, anaerobias, etc.

Pruebas para la identificación del género Streptococcus

En Agar sangre, las colonias son redondas de 0.5 a 2.0 mm de diámetro,  pueden ser mucoides, mate  o  lustrosas.  Las colonias mucoide contienen material capsular formado con ácido hialurónico, que da  a la colonia un aspecto húmedo, brillante y suave. Las colonias lustrosas son mas pequeñas, lisas y brillantes. Las colonias mate tienen apariencia opaca y rugosa.Crecen de forma óptima a 37º C y  en pH. 7.4, en Agar sangre  y producen alfa o beta hemólisis.

 Streptococcus B hemolíticus.- A la tinción de Gram tienen forma de cocos, forman, pares o cadenas, los  cocos individuales son esféricos, son Gram positivos y miden de 0.5 a 1  micra de diámetro son, anaerobios facultativos, producen beta hemólisis, son acidógenos, acidofílicos, fermentadores de glucosa y maltosa.

Estas tres últimas carácterísticas son la base de las pruebas bioquímicas para la identificación de especie,  se realizan en caldos que contienen un carbohidrato específico para su metabolismo mas un indicador de pH, el Rojo de fenol, en las pruebas positivas, estos medios de color rosa intenso a rojo, viran al color amarillo debido a la acidez que produce la fermentación ácida de estos carbohidratos, de ahí los términos acidógenos y acidófilos.


Pruebas  para la  identificación de Staphylococcus aureus

Las colonias de S. Aureus en S110 son redondas de 1 a 2 milímetros de diámetro, lisas, convexas y resplandecientes ser de color amarillo dorado, verdosas o blancas. A la tinción de Gram los estafilococos son células esféricas de una micra de diámetro aproximadamente, distribuidas en grupos irregulares semejantes a racimos de uvas, en cultivos líquidos se encuentran también cocos aislados, en pares, en tetradas o en cadenas. Los cocos jóvenes son  Gram positivos.



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S. aureus puede ser aislado selectivamente, en el medio de cultivo  Agar Sal con Manitol debido a su capacidad de producir manitolasa, enzima que degrada al manitol (manosa), carbohidrato que utiliza para su metabolismo, acidificando el medio de cultivo, reacción en la que se observa un cambio de coloración del medio de cultivo, de rosa intenso a amarillo, gracias al rojo de fenol que se adiciona al medio como indicador de pH.

            Prueba de la catalasa.- Staphylococcus aureus produce catalasa, enzima que convierte el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada H2O2) en agua y oxígeno, este último se identifica por la liberación de burbujas al adicionar agua oxigenada a las colonias cultivadas en S110 o en Agar sal manitol.

Prueba de la coagulasa (factor de patogenicidad).- Staphylococcus aureus produce coagulasa, proteína de tipo enzimático que coagula el plasma humano oxalatado o citratado (ver pag. 17, práctica No. 2 en módulo de Piel y músculo esquelético)


Pruebas para la identificación de Streptococcus pneumoniae

En los medios de cultivo Agar sangre con soya tripticasa, infusión cerebro corazón enriquecido con el 5% sangre desfibrinada, después de 24 horas de incubación se observan colonias circulares, brillantes, convexas y mucoides de 1 a 4 milímetros de diámetro que desarrollan mas tarde una meseta central con bordes elevados produciendo alfa hemólisis. El Agar sangre requiere de un pH de 7.4 a 7.8, concentraciones elevadas de CO2 y temperatura óptima de 35 a 37° C. Para su crecimiento.

            Los neumococos son cocos Gram positivos,  de forma oval o esférica, que miden de 0.5 a 1.25 micras de diámetro. Los diplococos típicos suelen observarse en Agar sangre en forma de cocos aislados, en pares  o formando cadenas, poseen una cápsula formada por polisacáridos que permiten una fácil tipificación por lisis con sales biliares o con antisueros específicos.

            La fermentación de la glucosa es una prueba bioquímica que permite la tipificación  de Streptococcus pneumoniae. En caldo glucosado produce ácido láctico como producto final de la glucosa, la acidez se evidencia por el cambio de color del medio de rosa intenso a amarillo gracias al indicador de pH Rojo de fenol. Son catalasa  y  peroxidasa negativos. La técnica de tinción. de cápsula con tinta china es otra prueba definitiva para la midentificación de género. (ver práctica 6 páginas 86 a 93 del módulo Aparato Respiratorio)



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Pruebas para la identificación de Haemophylus influenzae

El Agar chocolate permite su aislamiento selectivamente por las necesidades  que tienen estas bacterias de los factores V y X de la sangre. En este medio las colonias requieren de 36 a 48 horas de incubación para su desarrollo. Las colonias son relativamente pequeñas con diámetro aproximado de un milímetro, son redondas, convexas e iridiscentes. A la tinción de Gram ,los microorganismos típicos son cocobacilos Gram negativos con cápsula, de 1.5 micras de largo por .5 micras de diámetro.


Identificación de géneros y especies de la Familia Enterobacteriaceae

            La familia Enterobacteriaceae  (enterobacteriáceas), está formada por un grupo heterogéneo de bastoncillos Gram negativos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y animales. Dentro de la familia Enterobacteriaceae  se han incluido a mas de 20 géneros y 100 especies,  se encuentran entre otros, a los géneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, etc., que se pueden aislar del hemocultivo.

            Las Enterobacteriáceas son anaerobias o aerobias facultativas, fermentan gran cantidad de carbohidratos, poseen estructuras antigénicas complejas, producen toxinas y otros factores de virulencia. 

La familia de Enterobacteriáceas se caracteriza desde el punto de vista bioquímico por la capacidad de algunos de sus miembros de reducir nitratos a nitritos, de fermentar glucosa con producción de ácido o gas, o ambos y son negativos a la oxidasa.

            Para facilitar la identificación de estos bacilos entéricos patógenos, se dispone de tres medios de cultivo, TSI, SIM y Agar con urea, que resultan ser diferenciales por algunas reacciones bioquímicas que se producen como resultado del metabolismo bacteriano específico, no solo de género, sino también de especie.

Las pruebas bioquímicas que pueden ser demostrables en estos medios son:

·         Metabolismo o fermentación de hidratos de carbono como glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, etc., La reacción de fermentación se evidencia por un cambio de color, de rojo normal del medio de cultivo por la adición al medio de Rojo de fenol, indicador de pH., al color amarillo que se produce por la acidificación del medio   por acción de los ácidos láctico o pirúvico.



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·         La producción de sulfuro ferroso que se demuestra por el ennegrecimiento del medio  de cultivo. En esta reacción se produce sulfuro ferroso a partir del aminoácido cisteína o de tiosulfato sódico que contiene el medio de cultivo. En la primera etapa el tiosulfato o la cisteína son reducidos con la participación de las enzimas cisteína o tiosulfato desulfhidrasas para formar ácido sulfhídrico (H2S) mas amoníaco (NH3), en la segunda etapa el ácido sulfhídrico (H2S)  reacciona con la sal fuerte que contiene el medio de cultivo, citrato de amonio férrico, para formar sulfuro ferroso que produce un precipitado de color negro en el medio.

·         Producción de Indol, se produce a partir del triptófano que se encuentra en las peptonas del medio de cultivo TSI. El triptófano puede ser oxidado por la acción de enzimas bacterianas, las triptofanasas, que dan origen a tres productos indólicos, Indol, escatol y ácido indolacético en reacciones bioquímicas específicas. La desaminación del triptófano produce Indol que se demuestra adicionando unas cuantas gotas del reactivo de Kovac o de Ehrlich al medio, formándose un anillo de color rojo en la parte superior del medio de cultivo.

·         Movimiento bacteriano conferido por flagelos, cuando el medio SIM es inoculado por punción cuidadosamente con el asa recta, las cepas móviles crecen lejos del sitio de la inoculación.

·         La ureasa es una enzima bacteriana capaz de hidrolizar  a la urea formando dos moléculas de amoníaco que finalmente es convertido en carbonato de amonio, estos compuestos derivados de la urea alcalinizan el medio de cultivo que cambia de color de rosa tenue (durazno) a rojo por el indicador  de pH rojo de fenol .

TSI Agar con tres azúcares y hierro.- TSI es un medio de cultivo sólido en tubos inclinados con pico de flauta, el medio es  de color rojol por el indicador de pH rojo de fenol, contiene lactosa en la superficie, sacarosa y glucosa en el fondo del tubo.  El agar con tres azucares  y hierro lo ideó Hajna para diferenciar los bacilos  entéricos Gram negativos por su habilidad para atacar la glucosa, lactosa y sacarosa y liberar sulfuros.

TSI.- Fórmula en Gramos por Litro de Agua Destilada

Polypeptone………………….   20.0              Cloruro de Sodio ……………     5.0
Lactosa…………………...…...  10.0              Sacarosa……………………...  10.0
Glucosa……………………........ 1.0              Sulfato de Amonio Ferroso …... 0.2  
Tiosulfato de Sodio……………  0.2               Rojo de Fenol………………... .. 0.025
Agar. ……………………………13.0               pH final 7.3   +



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Preparación

Se suspenden los 59.4 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mézclese bien y caliéntese agitando de vez en cuando. Hiérvase durante 1 ó 2 minutos para disolver. Distribúyase en tubos de ensayo, llenándolos hasta su tercera parte. Esterilícese a no más de 118°C durante 15 a 17 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada, de tal manera que produzcan fondos profundos con pico de flauta.

Técnica de siembra

El Agar TSI inclinado se debe inocular a partir de las colonias  seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey o de otras fuentes apropiadas. EL cultivo se debe estriar en la porción inclinada y picar hasta un centímetro antes del fondo. Los cultivos se leen después de 18 a 48 horas de incubación a 37° C.

Metabolismo de Carbohidratos.- Fundamento.- El metabolismo bacteriano de alguno o de los tres carbohidratos da como resultado la producción de ácido pirúvico y ácido láctico (fermentación ácida), por lo que medio de cultivo se acidifica, esta acidez se evidencia por un cambio de color del medio de rojo o rosa intenso al color amarillo por la acción del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservándose el medio de cultivo de color rojo.

 Escherichia coli fermenta los tres azúcares por lo que todo el medio de cultivo, tanto el pico de flauta como el fondo, cambiarán al color amarillo.

El género Salmonella fermenta glucosa pero no lactosa, por lo que el pico de flauta permanece rojo, pero el fondo será de color amarillo.


Producción de Sulfuro ferroso en TSI.-Fundamento.- Algunas bacterias son capaces  de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio,  este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar  ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por un precipitado de color negro en el medio. E. Coli y Shigellas son negativas.

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SIM Azufre Indol y movimiento .- Medio de cultivo sólido en tubos de color ligeramente ámbar transparente. Se emplea para la determinación de la producción de sulfuro ferroso, formación de Indol y movimiento de enterobacterias.

Fórmula en gramos por litro de agua destilada

Trypticase.................................20.0 grs.           Thiotone (peptonas)...........  6.1 grs.
Sulfato de hierro y amonio.........  0.2 grs.          Tiosulfato de sodio.....…...... 0.2 grs.
Agar................…..................... 3.5 grs.              pH final  7.3 +

Preparación

Se suspenden los 30 gramos del material seco en un litro de agua destilada, mézclese bien y cuando se obtenga la suspensión uniforme, caliéntese agitando de cuando en cuando y hiérvase durante un minuto o hasta su disolución. Distribúyase en tubos de ensayo, llenándolos hasta su tercera parte. Esterilícese a 121°C a 15 libras de presión durante 15 minutos


Técnica de siembra

El Agar SIM se debe inocular por picadura en el centro hasta la mitad o un centímetro antes del fondo. Las muestras se toma de las colonias  seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey


Sulfuro ferroso.- Fundamento.- Algunas bacterias son capaces  de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfato reductasa.

Este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio,  este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar  ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferrico que contiene el medio de cultivo para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio.

Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por el color negro del medio. Escherichia coli y Shigellas no producen H2S por lo que el medio conserva su color original.



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Indol.- Fundamento.- El alto contenido de trypticase (triptófano) en el medio SIM, lo hace ideal para la producción de indol. El triptófano puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, escatol y ácido indolacético) por reacciones específicas de la enzima,  liberando una molécula de amoniaco.

La desaminación del triptófano produce Indol. La inmediata  aparición de un anillo de color  rojo cuando  se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol y se considera una prueba positiva.  Eschericia coli es capaz de producir Indol por lo que al agregar 5 gotas del reactivo de de Kovac, se forma un anillo rojo en la superficie del medio SIM.


Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos perítricos los géneros Salmonella, Proteus, Escherichia coli se desplazan alejándose de la picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura.  

Los géneros Klebsiella y Shigella no tienen movimiento.



LIA.-  Agar lisina con hierro.  Medio sólido en tubos con pico de flauta de color rosa.

·         Determina si los miembros de la familia Enterobcteriaceae descarboxilan o  desaminan la lisina.
·         Ayuda en la identificación de especies de Salmonella la mayoría de la cuales son H2S positivas y lisina positivas.

Fórmula en gramos por litro de agua

Agar ....................................15.0 g                 Peptona de gelatina........... 5.0 g
Extracto de levadura..............3.0 g                 Glucosa...............................1.0 g
L-lisina.................................. 1.0 g                 Citrato férrico-amónico........ 0.5g
Tiosulfato de sodio anhidro... 0.4 g                 Púrpura de bromocresol..........2.0 mg
Agua destilada................ 1000 ml                  pH final: 6,7 + 0,2

Fraccionar en cantidades de 4 ml.  (tubos para la prueba 13 X 100 mm).
Agar inclinado extremo inferior profundo, ( anaerobio) con pico de flauta corto.



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Técnica de siembra.-  Con el asa bacteriológica recta, estriar el pico de flauta y punzar el fondo del medio dos veces. Dejar las tapas del medio de cultivo ligeramente flojas. Incubar durante 18 a 24 hrs., a 35° C.

Descarboxilación de la lisina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas, atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.

                          R-CH-NH2- COOH   ---->    R-CH2-NH +  CO2
                      aminoácido                                       amina        dióxido de carbono


                    aminoácido                                     amina      dióxido de carbono

Existen numerosas enzimas descarboxilasas utilizadas para la identificación bacteriana, las tres mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas.

Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan  cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico. Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos.  La descarboxilación que producen estas enzimas, esta restringida a  los  aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH).

Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La descarboxilación es irreversible no oxidativa y por lo general requiere una coenzima común, fosfato de piridoxal,  que refuerza la actividad de las descarboxilasas.  El aminoácido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina, una diamina y dióxido de carbono, por la acción de la enzima especifica lisina descarboxilasa.




El aminoácido L- ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina  y dióxido de carbono.



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Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae  causan una fermentación inicial de la glucosa con producción de ácidos que originan un cambio en el indicador de pH del púrpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubación. En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen lisina descarboxilasa  forman una amina, cadaverina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestándose  por un nuevo viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol, a la alcalinidad (color púrpura).

Interpretación de la descarboxilación de la lisina

Positivo (+): El pico de flauta se observa de color púrpura (alcalino) y el extremo inferior púrpura (alcalino), puede haber  producción de ácido sulfhídrico (H2S) o sin el.
Negativo (-) pico de flauta púrpura y el extremo inferior amarillo (ácido) que indica solo la fermentación de la glucosa sin descarboxilación de la lisina.

La reacción de descarboxilación en el extremo inferior (púrpura), puede enmascararse por el color negro del sulfuro ferroso a partir del H2S que producen algunas bacterias. La producción de H2S  se produce en un medio alcalino (púrpura).

Producción de sulfuro ferroso en LIA. Algunas bacterias son capaces  de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio,  este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar  ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio


MIO
(Motility-Indole-Ornitine o Motilidad-Indol-Ornitina).- Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la producción de Indol y a la descarboxilación de la ornitina.

Fórmula en gramos por litro:
Dextrosa...........................1.0 grs.             Extracto de levadura.................3.0 grs.
Peptona............................10.0 grs.           Tripteína..................................10.0 grs
Clorhidrato de Ornitina........5.0 grs.           Agar..........................................2.0 grs.
Púrpura de bromocresol........0.02 grs.       pH final: 6.5 ± 0.2

 

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Los tubos se siembran por punción con asa recta hasta un centímetro antes del fondo.  Incubar por 24 horas a 37° C.

Movilidad. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación, mientras en las no móviles crece a lo largo de la línea de siembra.

Indol.- Fundamento.- El triptófano que contiene el medio MIO puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias, utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, metilindol y ácido indolacético) y liberando una molécula de amoniaco. La desaminación del triptófano produce Indol.  La inmediata  aparición de un anillo de color  rojo cuando  se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas, indica la presencia de Indol. La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad bacteriana.

Descarboxilación de la ornitina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.

                                     R-CH-NH2-COOH -> R-CH2- NH2 + CO2
                                    aminoácido                              amina    dióxido de carbono

Las tres enzimas descarboxilasas bacterianas mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas. Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan  cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico, ornitina. Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos.

La descarboxilación que producen estas enzimas, esta restringida a  los  aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH). El aminoácido L- ornitina tiene esta características y es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina  y dióxido de carbono.

Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae  causan una fermentación inicial de la glucosa con producción de ácidos que originan un cambio en el indicador de pH del púrpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubación. 




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En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen ornitina descarboxilasa  forman una amina, putresina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestándose  por un nuevo viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol, a la alcalinidad (color púrpura).

Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis  se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas.

La reacción positiva de la ornitina está dada por un color púrpura del medio debido a la fermentación de la glucosa que reduce el pH proporcionando condiciones óptimas para la decarboxilación de la ornitina de la fórmula. Si ocurre la decarboxilación de la ornitina el pH sube y el color del medio se vuelve púrpura gracias al indicador púrpura de bromocresol. Los cultivos negativos a ornitina producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior.


SIMMONS, AGAR CITRATADO DE

El Agar Citratado de Simmons.- Medio sólido de color verde en placas o  en tubos inclinados, se usa para diferenciar las bacterias entéricas Gram negativas, basándose en la utilización de citrato.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua Destilada
Fosfato Monobásico de Amonio  .................................................................     1.0
Fosfato Dipotásico  ......................................................................................        1.0
Cloruro de Sodio  .........................................................................................        5.0
Citrato de Sodio  ..........................................................................................         2.0
Sulfato de Magnesio  ...................................................................................       0.2
Agar  ............................................................................................................        15.0
Azul se Bromotimol  .....................................................................................        0.03

Preparación

Suspender  los 24.2 gramos de polvo en un litro de agua destilada.  Déjese remojar durante 5 a 10 minutos.  Mezclar bien y calentar suavemente agitando de vez en cuando hasta que el medio hierva durante 1 o 2 minutos.

 Distribuyese en tubos y esterilícese en autoclave a 121°C. (15 libras de presión) durante 15 minutos.  Se deja enfriar en posición inclinada, aunque también se puede emplear como medio en placas.



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Técnica de siembra

Se pueden hacer cultivos en placa con técnica de aislamiento o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y picando el fondo.

 Fundamento.- Solo los organismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono crecen en el Agar Citratado de Simmons. El citrato es obtenido  del citrato de sodio que contiene el medio para ser incorporado directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Krebs) para su metabolismo y producción de energía. Esta reacción es catalizada por la citrato desmolasa o citratasa enzimas bacterianas que requieren de un medio alcalino y de cationes divalentes como magnesio para su activación.

            Algunas enterobacterias son capaces de degradar las sales de amonio  (fosfato monobásico de amonio) del medio para formar amoníaco (NH3) para ser utilizado como fuente nitrogenada para su metabolismo. El nitrógeno liberado en forma de amoníaco  es convertido en hidróxido de amonio (NH4OH) mas fosfato orgánico, estos dos productos proporcionan las condiciones óptimas para la activación de la citratasa   que obtiene al citrato y lo incorpora al ciclo de Krebs.

La aparición de un crecimiento bacteriano visible indica la utilización del citrato como fuente de carbono. De manera indirecta se comprueba por un cambio de color del medio de cultivo, del color verde normal, al color azul que indica la alcalinización del medio por el del indicador de pH, azul de bromotimol.

Los géneros Salmonella y Proteus generalmente sin citrato positivas, en cambio Klebsiella, Shigellas y E.coli son negativas.



AGAR CON UREA DE CHRISTENSEN.- Es un medio de cultivo sólido en tubos con pico de flauta que se utiliza para detectar la actividad de la ureasa, enzima bacteriana que hidroliza a la urea convirtiéndola en dos moléculas de amoníaco que finalmente forman carbonato de amonio.


Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo que cambie de color, de rosa tenue a rojo por la acción del indicador Rojo de fenol.



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Fórmula en gramos por litro de agua destilada.
Peptona............................... 1.0  gr.           Cloruro de sodio................  5.0 grs.
Fosfato monopotásico......... 2.0 grs.          Glucosa .............................. 1.0 grs.
Urea...................................20.0 grs.           Rojo de fenol.......................0.012 grs.
pH final  6.8 +    

Preparación
Se pesan 3.87 grs. Para cada  100 ml de agua destilada y se disuelve sin calentar.
Se distribuye en tubos estériles de  13 X 100 mm, en fracciones de 2 ml.
Esterilizar en autoclave  de 115 a 121° C a 15 libras de presión por 15 minutos.
Déjense enfriar los tubos a 50° C y colocar en forma inclinada.

Técnica de siembra
Se debe estriar superficialmente con un inóculo grande, el fondo sirve como control del color, por lo que no debe puncionarse.

            El Agar con urea de Christian elimina la necesidad de que los microorganismos utilicen el amoníaco como única fuente de nitrógeno para su metabolismo, la glucosa que contiene el medio permite el crecimiento de un buen número de géneros que además podrán evidenciar la producción de ureasa alcalinizando el medio de cultivo haciendo que cambie del color normal al rojo por el indicador Rojo de fenol.          La mayor parte de las especies del género Proteus dan una reacción fuertemente positiva a las 24 horas de incubación. Otros géneros de bacterias paracólicas dan una pequeña reacción positiva desde las 6 primeras horas de incubación que se intensifica hasta 4 cruces hasta después de tres días. Otros géneros menos positivos a la ureasa dan una reacción leve después de 6 días.


Material para el desarrollo de la práctica

1 juego de medios de cultivo diferenciales para la identificación de enterobacterias, TSI, SIM, LIA, MIO, Citrato de Simmons, Caldo urea.

1 tubo con plasma citratado.
1 frasco con peróxido de hidrógeno (H2O2)

Microscopio
Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica.
Juego de reactivos para la tinción de Gram.
Portaobjetos y cubreobjetos.




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Desarrollo de la práctica

En caso de haberse desarrollado algunas colonias en el medio de agar sangre, hacer un reporte de la morfología colonial y del tipo de hemólisis en su caso, además, hacer un frotis para la tinción de Gram.

En caso de haber crecimiento en el medio S 110, hacer un reporte de las características morfológicas de las colonias, hacer la pruebas de la peroxidasa y coagulasa, hacer un frotis y tinción de Gram para la identificación de Staphylococcus aureus.

De las colonias desarrolladas en agar EMB o Agar Mc Conkey  tomar muestras para sembrar en cada uno de los medios de cultivo diferenciales para enterobacterias, TSI, SIM, LIA, MIO, Citrato de Simmons, Caldo urea.

Interpretar los resultados, compararlos con la tabla de pruebas bioquímicas por géneros y especies.


Analizar y discutir el diagnóstico con su asesor. 














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